基于AirID的异双功能分子细胞内邻近靶标验证方法：CRBN与VHL结合剂在靶蛋白降解中的交互组学分析

本研究针对异双功能分子（如PROTACs）在靶蛋白降解中的关键科学问题，开发了基于AirID邻近生物素化酶的细胞内靶标验证系统。研究人员通过融合CRBN的沙利度胺结合域（ThBD）或全长VHL与AirID，成功实现了六种异双功能分子诱导的靶蛋白交互组分析，揭示了不同E3连接酶结合剂对靶蛋白邻近互作谱的差异化影响。该研究为PROTACs的机制解析和优化设计提供了创新工具，相关成果发表于《Communications Biology》。

　　

在药物研发领域，靶向蛋白降解技术（Targeted Protein Degradation, TPD）正掀起一场革命。其中，蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）作为异双功能分子的代表，通过同时结合靶蛋白和E3泛素连接酶，诱导靶蛋白的泛素化降解。然而，这类分子在细胞内的作用机制仍存在两大关键问题：一是不同E3连接酶（如CRBN和VHL）对靶蛋白互作网络的影响差异不明；二是缺乏高效验证细胞内靶标互作关系的方法。

为解决这些问题，Kohdai Yamada等研究团队在《Communications Biology》发表了一项创新研究。他们利用自主开发的邻近生物素化酶AirID（Ancestral BirA for proximity-dependent biotin identification），构建了两种验证系统：将AirID与CRBN的沙利度胺结合域（ThBD）或全长VHL融合，建立了可在活细胞内实时捕捉异双功能分子诱导的蛋白互作网络的技术平台。

研究主要采用了以下关键技术：1）基于小麦无细胞蛋白合成系统表达AirID融合蛋白；2）AlphaScreen生化互作检测技术；3）链霉亲和素pull-down结合质谱（LC-MS/MS）分析；4）使用MM1.S多发性骨髓瘤细胞、HCC-827-Luc肺癌细胞和LNCaP前列腺癌细胞构建稳定表达细胞系。

比较不同E3结合剂PROTAC的交互组差异

研究首先以BRD4为靶点的两种PROTAC（ARV-825和MZ1）为模型，发现虽然二者使用相同的JQ1靶向结合剂，但分别依赖CRBN和VHL时呈现显著不同的生物素化谱。VHL-AirID系统检测到更多BRD蛋白的生物素化位点，提示E3连接酶的选择直接影响靶蛋白的互作模式。

ThBD-AirID系统的开发与验证

通过将AirID与CRBN的ThBD（318-424aa，含C366S突变）融合，成功实现了对ARV-825依赖的BRD3等靶蛋白的特异性标记。值得注意的是，该系统避免了全长CRBN可能引起的泛素化竞争，且不整合入CRL4复合体，为靶标验证提供了更精准的工具。

EGFR靶向PROTAC的交互组分析

在非小细胞肺癌模型中，研究比较了两种EGFR靶向PROTAC（MS154和MS39）的互作差异。除共同捕获EGFR和GAK（cyclin G-associated kinase）外，VHL依赖的MS39还特异性地标记了HER2，揭示了血清培养条件下EGFR家族成员的交互差异。

非降解型异双功能分子的应用拓展

研究还合成了以格尔德霉素（GA）为靶向剂、沙利度胺衍生物为E3结合剂的异双功能分子（GA-TD）。通过AlphaScreen和细胞实验证实，含特定连接子的GA-TD-5能有效诱导HSP90与ThBD-AirID的邻近互作，为这类分子的优化设计提供了范例。

临床阶段PROTAC的作用机制解析

针对处于临床试验阶段的ARV-110（靶向雄激素受体AR），研究发现其诱导的AR生物素化主要发生在核内，且N端结构域的标记程度高于配体结合域（LBD）。结合JQ1处理实验，提示ARV-110可能通过破坏BRD4-AR相互作用促进AR降解。

这项研究的重要意义在于：1）建立了可同时分析CRBN和VHL两类主要E3连接酶的通用技术平台；2）揭示了E3连接酶选择对PROTAC作用机制的深远影响；3）为临床阶段PROTAC的作用机制提供了新见解；4）拓展了AirID技术在非降解型异双功能分子研究中的应用。这些发现不仅推动了靶向蛋白降解领域的方法学创新，也为理性设计下一代治疗药物提供了重要依据。