硅基罗丹明介导的近红外光控邻近标记技术在体外和体内的创新应用

本研究针对活细胞荧光成像无法解析蛋白质动态互作网络的瓶颈问题，开发了基于硅基罗丹明(SiR)的SeeID技术，实现了近红外光控的时空特异性蛋白质邻近标记。研究人员通过将SiR重构为光催化剂，结合其荧光特性，首次在活细胞中同步完成蛋白质动态追踪与互作组分析，并成功应用于小鼠大脑皮层2 mm深度的在体标记。该技术为解析KRAS致癌突变体互作网络、线粒体自噬过程中Parkin-蛋白酶体动态关联等关键生物学问题提供了新工具，相关成果发表于《Nature Communications》。

　　

在生命科学领域，解析蛋白质的动态互作网络犹如破解细胞活动的"社交密码"。传统荧光成像虽能捕捉蛋白质的时空轨迹，却无法揭示其"朋友圈"的组成；而质谱技术虽能鉴定互作蛋白，却像拍摄静态照片般丢失动态信息。这种"看得见但摸不着"的困境，在KRAS致癌突变体研究和线粒体自噬等动态过程中尤为突出。更棘手的是，现有邻近标记技术如APEX需细胞毒性过氧化氢，TurboID存在本底标记高的问题，且均缺乏深组织穿透能力。

为突破这些限制，Wenjing Wang等研究者独辟蹊径，将广泛应用于超分辨成像的硅基罗丹明(SiR)进行功能拓展，开发出SeeID技术。该技术巧妙利用SiR的双重特性：作为荧光团实现亚细胞定位，作为光催化剂在660 nm近红外光激发下产生单线态氧(¹O₂)，驱动组氨酸特异性标记。通过AAV病毒递送HaloTag融合蛋白至小鼠大脑皮层，首次实现2 mm深度的在体时空标记，为神经环路研究开辟新途径。

关键技术包括：1）光催化机制验证：通过SOSG探针证实SiR-Halo复合物的单线态氧生成能力；2）探针优化：筛选出3-乙炔基苯胺(3-EA)作为最优亲核标记探针；3）动态互作解析：结合BL-918诱导的线粒体自噬模型，实现Parkin转位过程的"成像-标记"同步分析；4）深度组织应用：采用现成660 nm LED光源建立小鼠脑皮层标记方案。

内质网膜蛋白质组学分析

通过比较SeeID与miniSOG的标记效率，发现SeeID对Sec61β标记的组氨酸位点增加40%，且90%标记蛋白为已知分泌途径组分，证实其空间特异性优于APEX2和TurboID。

KRAS互作组发现

在SW1573和HeLa细胞中鉴定出427个KRAS互作蛋白，其中212个为新发现。通过邻位连接实验(PLA)验证了AXL、OSBPL5等蛋白与KRAS^G12C的相互作用，为靶向治疗提供新线索。

Parkin动态互作图谱

发现线粒体自噬早期（2小时）蛋白酶体复合物29个组分与Parkin共定位，4小时后减少，揭示泛素-蛋白酶体系统在受损线粒体降解中的时序调控机制。

在体标记应用

AAV-Halo-TM转导的小鼠视觉皮层经660 nm照射后，质谱鉴定出60个突触膜相关蛋白，包括神经递质受体Gabra2和囊泡运输调控因子Syt5。

这项研究的意义在于：1）创建首个兼具荧光追踪和邻近标记的双功能系统，突破传统技术"顾此失彼"的局限；2）通过SiR的荧光开关特性，将非特异性标记降低至MB催化剂的1/5；3）为KRAS突变肿瘤和神经退行性疾病研究提供动态互作数据库。作者特别指出，尽管SiR-CA的单线态氧量子产率(Φ_Δ=0.00064)较低，但其强吸收特性足以产生有效标记信号。未来优化催化剂效率有望将照射时间从30分钟缩短至10分钟，进一步提升时间分辨率。

该成果的独特价值在于将"看得见"的成像与"摸得着"的组学无缝衔接，如同为细胞生物学研究装配了"全息记录仪"。《Nature Communications》审稿人评价其"重新定义了光控邻近标记的技术边界"，为在体研究蛋白质动态网络树立了新标准。