基质刚度通过Piezo1/Ca2+/ROS轴破坏干细胞稳态导致雄性衰老睾酮下降的机制研究

本研究揭示了衰老睾丸中细胞外基质（ECM）刚度升高通过Piezo1/Ca2+/ROS信号轴促进Gli1蛋白泛素化降解，进而抑制干细胞（SLCs）增殖分化能力的关键机制。该发现为靶向生物力学信号治疗男性睾酮缺乏提供了新策略，具有重要临床转化价值。

　　

ECM刚度在衰老睾丸中升高并抑制SLC功能

单细胞测序分析显示，衰老睾丸间质中ECM成分沉积增加，伴随成纤维细胞和巨噬细胞比例上升。原子力显微镜检测证实老年小鼠（24月龄）睾丸间质ECM刚度达25 kPa，显著高于年轻组（5 kPa）。Masson和PAS染色显示睾丸白膜增厚、糖蛋白沉积增加。体外实验表明，高刚度（25 kPa）培养环境使干细胞（SLCs）增殖标志物Ki67表达降低40%，克隆形成能力下降2.3倍，分化后睾酮分泌量减少58%。

Piezo1介导的钙超载引发线粒体功能障碍

机械敏感离子通道Piezo1在高刚度基质中表达上调2.1倍，导致钙离子（Ca²⁺）内流增加。Fluo-4AM荧光检测显示，25 kPa组细胞内Ca²⁺浓度较5 kPa组升高3.5倍，特异性抑制剂Dooku1可逆转此现象。透射电镜观察到高刚度组线粒体呈现碎片化形态，ATP产量下降62%，线粒体活性氧（ROS）水平升高4.2倍。抗氧化剂NAC处理可使SLCs增殖能力恢复至软基质的85%。

ROS通过泛素化途径降解Gli1蛋白

蛋白稳定性实验显示，高刚度环境下Gli1蛋白半衰期从12小时缩短至4小时。免疫共沉淀证实25 kPa组Gli1泛素化水平增加3.8倍，蛋白酶体抑制剂MG132可阻止其降解。机制上，ROS激活AMPK通路促进β-TrCP介导的Gli1泛素化，导致Hedgehog通路关键转录因子核定位减少60%。在3D培养模型中，1.25 mg/mL胶原I构建的高刚度环境使睾丸类器官直径缩小42%，而Dooku1处理可使其睾酮分泌量恢复2.1倍。

靶向干预的潜在治疗价值

研究构建了模拟体内微环境的睾丸类器官模型，证实低刚度（0.25 mg/mL胶原I）预处理可使衰老来源SLCs的CYP11A1表达提升2.4倍。临床转化方面，现有抗纤维化药物（如氯沙坦）或Piezo1特异性抑制剂（GsMTx4）可能成为改善睾丸生物力学微环境的新选择。该发现为男性迟发性性腺功能减退（LOH）提供了基于机械转导的治疗思路。

研究局限与展望

当前研究尚未明确ECM粘弹性与刚度的协同作用，且需在高脂/糖尿病等病理模型中验证普适性。未来需构建SLCs特异性Piezo1敲除动物模型，并开发靶向递送系统以解决全身给药的副作用问题。该机制可能拓展至其他机械敏感组织（如骨/软骨）的干细胞调控研究。