高效肌向性MyoAAV载体显著改善GSD IIIa小鼠模型的骨骼肌病变

本研究针对糖原累积症III型（GSD IIIa）多组织受累的治疗难题，开发了搭载细菌支链淀粉酶（pullulanase）的MyoAAV4A/4E新型载体。通过免疫耐受双启动子（LSP-CB Dual-Promoter）和RGD修饰肌向性衣壳的协同作用，在1×1013 vg/kg剂量下实现骨骼肌转导效率较AAV9提升10倍，显著清除心脏/肌肉糖原沉积并逆转尿Glc4生物标志物。该成果为降低基因治疗剂量依赖性肝毒性提供了新策略。

　　

糖原累积症III型（GSD III）是一种因AGL基因突变导致糖原脱支酶（glycogen debranching enzyme, GDE）缺陷的罕见遗传病，患者肝脏和肌肉中异常堆积的极限糊精引发进行性肝纤维化和肌无力。当前饮食疗法仅能缓解症状，而传统AAV9载体因需高剂量给药易引发肝毒性，且人类GDE cDNA（4.6 kb）超出AAV包装容量限制。Duke大学团队此前创新性采用细菌支链淀粉酶（2.2 kb）替代治疗，但骨骼肌转导效率不足仍是瓶颈。

为突破这一困境，Kuo-An Liao等研究者将双启动子调控的pullulanase表达框架包装至新型肌向性AAV衣壳（MyoAAV4A/4E）。这些经定向进化改造的载体表面展示RGD基序，可特异性结合肌肉组织高表达的整合素分子。研究通过GSD IIIa小鼠模型系统评估了载体性能，发现1×10¹³ vg/kg剂量下MyoAAV4A在骨骼肌的基因组拷贝数较AAV9提高5-8倍，伴随pullulanase活性增强3倍。

关键技术包括：① 人源化TIRF小鼠模型验证跨物种转导效率；② 实时PCR定量组织病毒载量；③ 特异性pullulanase活性检测（Megazyme K-PullG6试剂盒）；④ 糖原含量生化测定与PAS染色双重验证；⑤ 血浆ALT/AST/CK及尿Glc4等生物标志物分析；⑥ 握力测试、悬吊实验和跑步机评估运动功能。

MyoAAV4A和MyoAAV4E衣壳在GSD IIIa小鼠骨骼肌中表现出显著高于AAV9的转导效率

定量分析显示，MyoAAV4A在心肌和骨骼肌的AAV基因组拷贝数较AAV9提升2-4倍（如心肌1.59±0.46 vs 0.51±0.12 vg/二倍体基因组），pullulanase活性在膈肌达26.75±13.61 mU/mg，较AAV9组高3倍。

MyoAAV4A和MyoAAV4E衣壳在肌肉中实现更显著的糖原清除

生化检测显示MyoAAV4A治疗组骨骼肌糖原降低85%-95%，而AAV9组仅降低22%-57%。PAS染色证实MyoAAV4A几乎完全清除心肌和膈肌的糖原沉积。

MyoAAV4A-Dual-Pull载体在低剂量下仍保持疗效

1×10¹² vg/kg（标准剂量1/10）的MyoAAV4A即可使骨骼肌糖原含量低于高剂量AAV9组，尿Glc4水平恢复至野生型（2.1±0.8 vs 疾病组15.6±4.3 μg/mg肌酐）。

人源化小鼠验证临床转化潜力

免疫组化证实MyoAAV4A可有效转导嵌合肝中的人源肝细胞，为临床应用提供实验依据。

该研究首次将肌向性AAV载体应用于GSD III治疗，其创新性体现在：① 双启动子设计平衡免疫耐受与表达效率；② MyoAAV衣壳实现剂量降阶（1×10¹² vg/kg有效）；③ 细菌pullulanase克服AAV包装限制。值得注意的是，MyoAAV4A在悬吊试验中的优异表现（潜伏期延长3倍）提示其对上肢肌群的特异性改善，为临床方案优化提供新思路。未来需在大型动物模型中验证长期安全性，并探索年龄/性别对疗效的影响。