核糖体蛋白Rps29/uS14调控酵母18S rRNA成熟及其丰度调节渗透应激响应的分子机制

本研究针对核糖体蛋白Rps29/uS14在18S rRNA成熟过程中的作用机制展开深入探索。研究人员通过构建酿酒酵母RPS29A/RPS29B双基因缺失模型，结合多组学技术揭示了该蛋白通过调控20S pre-rRNA切割影响40S小亚基组装的分子机制。研究发现Rps29缺失导致细胞质中20S pre-rRNA加工受阻、核糖体组装因子释放延迟，意外发现低Rps29水平通过激活Hog1通路增强渗透应激适应能力。该研究为理解核糖体生物发生（ribosome biogenesis）质量控制提供了新视角，对Diamond-Blackfan贫血（DBA）等核糖体病的发病机制具有重要启示。

　　

在真核细胞中，核糖体作为蛋白质合成的分子机器，其精确组装对维持细胞稳态至关重要。核糖体生物发生（ribosome biogenesis）是一个高度协调的多步骤过程，涉及约79种核糖体蛋白（r-proteins）与4种核糖体RNA（rRNAs）的时空有序组装。其中，18S rRNA的成熟作为小亚基（40S）形成的关键环节，需要经历从35S pre-rRNA到20S pre-rRNA的多步加工，最终在细胞质中由Nob1内切酶完成D位点切割。然而，这一精密过程如何被特定核糖体蛋白调控仍存在诸多未知。

Rps29/uS14作为进化保守的小亚基头部结构蛋白，其基因突变与Diamond-Blackfan贫血（DBA）密切相关。临床研究发现DBA患者存在RPS29单倍剂量不足和18S rRNA前体（18SE）积累现象，但分子机制尚未阐明。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中存在RPS29A和RPS29B两个高度同源（91%序列一致性）的旁系同源基因，为研究该蛋白功能提供了理想模型。研究人员通过系统解析Rps29在rRNA加工、核糖体组装及应激响应中的多重作用，揭示了核糖体蛋白调控翻译机器质量控制的新机制。

研究主要采用以下关键技术方法：通过构建rps29a△和rps29b△单缺失菌株模拟DBA患者的单倍剂量不足状态；利用Northern blot和引物延伸（primer extension）分析rRNA加工缺陷；通过蔗糖密度梯度离心结合Western blot研究核糖体亚基分布和组装因子（RAFs）滞留情况；采用亚细胞分级分离技术确定20S pre-rRNA的胞质定位；借助双荧光素酶报告系统评估翻译保真度；通过生长表型分析和Hog1磷酸化检测阐明渗透应激响应机制。

【Rps29a和Rps29b蛋白由酿酒酵母中的两个旁系同源基因编码，缺失任一基因均会降低酵母生长速度】

研究发现缺失RPS29A或RPS29B均导致酵母在富营养培养基中生长显著减缓，倍增时间延长约50%。qRT-PCR和Western blot证实缺失株中RPS29转录水平和蛋白丰度均下降，且旁系同源基因间无法实现功能补偿。值得注意的是，另一个小亚基蛋白Rps26水平也显著降低，提示Rps29缺失可能影响核糖体蛋白网络的稳定性。

【缺失RPS29旁系同源基因导致40S水平降低并伴随60S亚基积累】

蔗糖梯度离心显示缺失株中40S峰显著降低而60S峰相对增加，亚基比例分析证实40S/60S比值下降约30%。双荧光素酶报告系统揭示缺失株标准AUG起始的翻译效率降低，但非常规UUG起始的误读率增加，表明Rps29缺失导致核糖体功能异质性。

【缺失RPS29旁系同源基因主要导致20S pre-rRNA积累，原因是D位点切割效率降低】

Northern blot分析显示缺失株中20S pre-rRNA水平增加3-5倍，而成熟18S rRNA仅轻微减少。引物延伸实验证实D位点切割效率显著下降，表现为18S rRNA 3'端1779/1780位腺苷二甲基化信号增强。其他加工位点（A0-A3）基本正常，说明Rps29特异性调控细胞质中20S pre-rRNA的最终成熟。

【缺失RPS29旁系同源基因导致20S pre-rRNA在细胞质中积累】

亚细胞分级实验证实积累的20S pre-rRNA定位于细胞质而非核内。多核糖体分析显示仅有少量20S pre-rRNA被整合至80S核糖体，表明Rps29缺失触发了质量控制机制阻止异常40S参与翻译。

【核糖体组装因子的释放因RPS29缺失而延迟】

Western blot分析发现缺失株中Ltv1、Enp1、Rio2和Pno1等晚期组装因子（RAFs）在40S亚基上的滞留时间延长。这些因子在正常条件下应随亚基成熟而逐步释放，其异常滞留与20S pre-rRNA加工缺陷形成正反馈循环。

【Rps29参与渗透应激响应】

表型分析发现缺失株在高盐（1M NaCl）条件下生长恢复快于野生型，且该效应独立于20S pre-rRNA加工。磷酸化检测显示缺失株中Hog1（p38 MAPK同源物）激活水平升高，表明低Rps29水平通过激活HOG通路增强应激适应能力。

该研究系统阐明了Rps29/uS14通过双重机制调控细胞稳态：一方面作为结构性组分确保18S rRNA正确加工和40S亚基成熟，另一方面通过调节HOG通路参与应激响应。在分子机制上，Rps29通过与Ltv1等组装因子协同调控40S头部结构域的形成，其缺失导致20S pre-rRNA加工缺陷和RAF释放延迟，模拟了DBA患者的分子表型。意外发现的渗透应激适应增强现象，揭示了核糖体蛋白丰度变化可作为一种调控翻译重编程的潜在机制。这些发现不仅深化了对核糖体生物发生质量控制的理解，也为开发针对核糖体病的干预策略提供了新思路。研究采用的酵母遗传学模型与人类疾病表型的良好对应，凸显了基础研究在解析复杂疾病机制中的独特价值。