MnmE-MnmG复合物冷冻电镜结构揭示tRNA修饰机制中的构象变化与甲基转移新见解

本研究通过冷冻电镜解析了tRNA修饰酶复合物MnmE-MnmG的α2β2和α4β2两种寡聚态结构，揭示了GTP结合触发的MnmE不对称构象变化及其C端螺旋（swivel helix）在5,10-CH2-THF与FADH2间传递甲基化基团的关键作用，为理解线粒体疾病相关突变机制提供了结构基础。

　　

在生命活动中，tRNA（转运RNA）的成熟需要经历复杂的化学修饰过程，其中位于34位"摆动尿苷"(U₃₄)的5-羧甲基氨基甲基(cmnm⁵)修饰对维持遗传密码解码准确性至关重要。细菌中这一修饰由MnmE和MnmG组成的瞬态复合物协同完成，但长期以来，这两个蛋白如何协调三种辅因子（MnmE结合的5,10-亚甲基四氢叶酸/5,10-CH₂-THF，MnmG结合的FAD和NADH）完成甲基转移反应，一直是未解之谜。更引人关注的是，人类线粒体中同源蛋白GTPBP3-MTO1的突变会导致心肌病、脑病等严重疾病，但致病机制同样模糊不清。

比利时布鲁塞尔自由大学的Laila Maes等研究者在《Nucleic Acids Research》发表的研究，通过冷冻电镜（cryo-EM）首次捕获了MnmE-MnmG复合物在GppNHp（非水解型GTP类似物）结合状态下的两种寡聚体结构（α₂β₂和α₄β₂），分辨率分别达到3.3?和4.0?。研究结合荧光滴定、等温滴定量热法（ITC）和分子动力学模拟等技术，揭示了GTP结合诱导的MnmE不对称构象重排如何驱动催化关键元件——C端"旋转螺旋"（swivel helix）在5,10-CH₂-THF和FAD结合位点间的穿梭，为阐明甲基转移机制提供了关键结构证据。

关键技术方法包括：1）冷冻电镜解析复合物三维结构；2）荧光滴定测定FAD结合亲和力；3）ITC分析蛋白互作能量学；4）分子动力学模拟构象转变路径；5）SAXS验证溶液状态构象。

主要研究结果

Cryo-EM结构揭示寡聚态转换

通过冷冻电镜观察到GppNHp结合状态下，复合物存在α₂β₂（一个MnmE二聚体结合一个MnmG二聚体）和α₄β₂（两端各结合一个MnmE二聚体）两种构象，验证了早期SAXS预测的GTP循环依赖的寡聚态转换。质量光度法显示纯化样品中α₄β₂占主导（>70%），但制样过程导致部分解离为α₂β₂。

MnmG构象变化与FAD结合调控

与MnmE互作的MnmG亚基（C链）表现出显著构象变化：1）C端螺旋域（554-629位）从无序变为有序；2）插入域2中的MnmG特异模体1（273-287位）形成稳定结构。有趣的是，仅互作亚基的FAD结合口袋出现清晰密度，荧光滴定证实MnmE使MnmG对FAD的亲和力提升10倍（K_D从74μM降至7μM），ITC显示FAD和GppNHp共同存在时，MnmE-MnmG结合强度最高（K_D=0.42μM）。

MnmE不对称构象重排机制

与游离状态对称二聚体不同，复合物中MnmE呈现显著不对称：

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  非互作亚基（A链）保持经典构象，其C端450FCIGK⁴⁵⁴模体插入5,10-CH₂-THF结合口袋

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  互作亚基（B链）发生112°螺旋域旋转，由"铰链螺旋"（hinge helix，120-150位）重排驱动，该区域在人类GTPBP3中对应E159V/A162P致病突变位点

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  关键"旋转螺旋"（436-454位）从THF口袋移位至MnmG的FAD结合位点，使K⁴⁵⁴氨基距FAD的N5原子仅5.8?

分子接力假说

研究者提出创新机制：1）K⁴⁵⁴亲核攻击5,10-CH₂-THF的亚胺正离子，获得甲基ene基团；2）构象变化将修饰后的K⁴⁵⁴转运至FAD位点；3）甲基ene基团转移形成FADH[N5=CH₂]⁺中间体。分子动力学模拟显示该过程通过螺旋域"扭转"实现，需部分解旋swivel helix完成重定位。

讨论与意义

该研究首次在原子水平揭示了MnmEG复合物的动态组装机制，阐明了三个重要科学问题：1）GTP水解循环如何通过寡聚态转换调控酶活性；2）空间分离的活性中心如何通过构象变化实现底物接力；3）致病突变如何影响该过程。特别值得注意的是，与MnmE互作的MnmG表面恰好重叠于tRNA结合位点，暗示可能存在"分步催化"模式：一个亚基负责甲基转移至FAD，另一亚基完成tRNA修饰。

这些发现为理解线粒体疾病（如GTPBP3的E159V导致心肌病）提供了分子基础——突变可能破坏构象转换或底物传递的关键界面。此外，研究揭示的"蛋白质构象重排介导的辅因子间底物转运"机制，为设计针对这类修饰酶的小分子调控剂开辟了新思路。