病毒RNA保守折叠结构揭示跨生物界核酸酶抗性的普适机制

研究人员针对病毒xrRNA（exoribonuclease-resistant RNA）如何抵抗宿主核酸酶的分子机制这一科学问题，通过解析植物病毒ST9a xrRNA的活性构象，首次揭示其与人类病原性黄病毒xrRNA共享核心结构基序——5'端保护环。该研究通过X射线晶体学、SAXS和体内外功能实验证实，破坏该基序会消除核酸酶抗性并减弱病毒感染，为RNA病毒对抗宿主防御提供了进化新见解，对设计合成xrRNA及抗病毒药物具有重要指导意义。

　　

在病毒与宿主持续数亿年的进化博弈中，RNA病毒发展出精妙的策略操纵宿主细胞机器。其中，外切核酸酶抗性RNA（xrRNA）作为"分子盾牌"，能抵抗宿主5'-3'外切酶Xrn1的降解，产生具有免疫逃逸功能的亚基因组RNA（sgRNA）。然而，感染动物（如黄病毒）与植物（如马铃薯卷叶病毒）的病毒xrRNA序列差异巨大，其是否共享保守的抵抗机制始终是未解之谜。

这项发表于《Nucleic Acids Research》的研究首次解析了植物病毒ST9a xrRNA的活性构象，揭示其与黄病毒xrRNA虽骨架迥异，却通过趋同进化形成相似的5'端保护环结构。研究人员结合X射线晶体学（2.9 ?分辨率）、SEC-SAXS（尺寸排阻色谱-小角X射线散射）和体内外降解实验，发现ST9a xrRNA通过9碱基对的假结（PK）形成保护环，并由镁离子"锁扣"稳定。关键突变实验证实，破坏保护环拓扑结构会完全消除Xrn1抗性，并使病毒复制减弱。生物信息学分析进一步在363种植物病毒中发现同类结构，证实该机制的广泛保守性。

主要技术方法：

1. 1.

   X射线晶体学解析ST9a xrRNA结构，采用分子置换-SAD策略

2. 2.

   SEC-SAXS分析溶液状态下的RNA构象动态

3. 3.

   体外Xrn1降解实验定量核酸酶抗性

4. 4.

   烟草本氏草（N. benthamiana）感染模型验证体内功能

5. 5.

   计算共变分析鉴定363个类xrRNA序列

研究结果：

1. 1.

   ST9a复制子3'UTR存在紧凑型xrRNA

   Northern blot和体外降解实验证实ST9a 3'UTR可产生Xrn1抗性片段，54nt最小元件足以抵抗降解。逆转录测序精确定位Xrn1终止位点与体内sgRNA 5'端一致。

2. 2.

   晶体结构揭示9碱基对假结的保护环架构

   

   结构显示PK与L2B发夹共轴堆叠形成完整螺旋环，A12/A13通过罕见顺式A-minor相互作用稳定PK小沟。突变实验表明缩短PK或破坏A-minor作用均会消除抗性。

3. 3.

   保守互作网络锚定保护环

   J1/2-L2B长程相互作用模仿tRNA的T-loop/D-loop互作模式，AGY基序（A42/G43）形成碱基三重体。U24-U51反向Watson-Crick碱基对与黄病毒xrRNA拓扑相似。

4. 4.

   镁离子协调结构稳定性

   

   晶体中发现的Ir(III)六胺结合位点揭示镁离子"锁扣"机制：一个金属离子被G32/G33磷酸和U44核糖配位，密封保护环开口。SAXS显示Mg²⁺使R_g从2.1nm降至1.9nm。

5. 5.

   类xrRNA结构在植物病毒中广泛分布

   共变分析发现285个新xrRNA，主要分布在Solemoviridae病毒基因间隔区，可能参与sgRNA产生。

结论与意义：

该研究揭示尽管黄病毒与植物病毒xrRNA采用不同骨架（三向连接PK vs 单茎环PK），但均通过形成5'端保护环实现核酸酶抗性。这种趋同进化机制为理解RNA结构对抗宿主防御提供了范式：

1. 1.

   保护环通过几何限制抵抗Xrn1的解旋力

2. 2.

   分层折叠路径（先定位5'端后闭环）解决基因组内组装难题

3. 3.

   镁离子依赖的稳定性提示环境因素可能调控病毒复制

   研究不仅为设计RNA稳定元件提供新模板（如54nt最小抗性模块），也为开发靶向xrRNA的抗病毒药物指明方向。未来探索更多病毒家族的xrRNA变体，将进一步完善对这类"分子化石"的进化认知。