Bcl3启动子中G-四链体依赖的转录调控：分子凝聚机制揭示癌症治疗新靶点

本研究揭示了G-四链体(G4)结构通过调控转录因子SP1的相分离过程来激活Bcl3基因表达的分子机制。研究人员发现Bcl3启动子中的G4结构能显著增强SP1结合并促进转录凝聚体(TC)形成，而转录产生的RNA G4结构则通过负反馈机制溶解SP1凝聚体。该研究为理解G4依赖的基因调控提供了新视角，并为靶向SP1凝聚体的癌症治疗策略奠定理论基础。

　　

在基因表达的精密调控网络中，DNA的二级结构扮演着关键角色。G-四链体(G-quadruplex, G4)是由鸟嘌呤(G)富集序列形成的四链结构，广泛存在于基因启动子区，调控着包括MYC、BCL2等致癌基因的表达。然而，G4结构如何动态调控转录因子(Transcription Factors, TFs)的富集及其与转录激活的关系仍不清楚。特别值得注意的是，特异性蛋白1(SP1)作为重要的G4结合转录因子，在多种癌症中过度表达，但其通过G4结构调控基因表达的具体机制尚未阐明。

为回答这些问题，Wanki Yoo?、Yi Wei Song?等研究人员在《Nucleic Acids Research》发表研究，以乳腺癌相关基因Bcl3的启动子为模型，系统研究了G4结构如何通过调控SP1的相分离过程来影响转录激活。研究团队采用生物信息学分析、圆二色谱(CD)、染色质免疫沉淀(ChIP)、荧光恢复实验(FRAP)和活细胞成像等多项技术，揭示了G4-SP1相互作用在转录调控中的核心作用。

关键技术方法包括：1) 通过ChIP-seq和QGRS分析筛选SP1富集且含G4的启动子；2) 采用CD光谱和DMS足迹法验证G4结构形成；3) 生物层干涉技术(BLI)定量SP1-G4结合动力学；4) 原子力显微镜(AFM)观察dsDNA中G4结构；5) PP7-PCP系统实时监测转录活性；6) 免疫荧光和FRAP分析细胞内SP1凝聚体动态。

研究结果部分：

Identification of Bcl3 promoter as a model of the SP1-enriched promoters containing G4 structure by applying the bioinformatics analyses

通过分析MCF-7细胞的SP1 ChIP-seq数据，从46,447个启动子中鉴定出72个SP1富集启动子，其中14个含有高G-score(>35)的G4形成序列。选择排名第三的Bcl3启动子(G-score=42)作为模型，因其结构简单(单G4序列和单SP1结合位点)且与乳腺癌密切相关。基因组分析显示SP1、MED1和RNA Pol II在Bcl3启动子共定位，RNA-seq证实其转录活性。

Effect of G4 formation in the Bcl3 promoter on transcriptional regulation

CD光谱显示Bcl3启动子G4在KCl存在下形成平行结构(260nm正峰)。突变分析表明G6A保留G4结构而G6/8A破坏结构。荧光素酶报告实验显示G4稳定性与启动子活性正相关：WT(100%)>G6A(98%)>GI/IVA(77%)>G6/8A(31%)>NC(15%)。G4配体TMPyP4降低WT但增强突变体活性，PDS则普遍增强活性，表明G4结构对转录调控的关键作用。

G4 regulates the binding of SP1 to the Bcl3 promoter

ChIP-qPCR证实SP1在Bcl3启动子的富集。BLI显示SP1与G4 DNA的结合亲和力(KD=2.36nM)显著高于非G4 DNA(KD=6-8nM)，且呈现协同性结合(希尔系数=4.42)。EMSA测得表观KD为19.1nM，表明G4结构延长了SP1在DNA上的停留时间。

Bcl3 promoter facilitates SP1 condensation in a G4-dependent manner

AFM证实WT dsBcl3在10% PEG8000和低盐条件下形成中心G4结构。体外实验显示SP1-Cy3仅在WT dsBcl3 G4存在时形成液滴，FRAP显示其动态性(Tau=42.4s)。细胞内SP1-mCherry与G4抗体(BG4)共定位，且G4配体PDS增加而TMPyP4减少SP1凝聚体面积。

G4-dependent SP1 condensation promotes transcription

PP7-PCP系统显示SP1凝聚体与转录位点共定位。WT启动子驱动的CFP信号强于突变体，且PDS增强而TMPyP4抑制信号。免疫荧光证实SP1与MED1和Pol II共定位，形成转录活性凝聚体。

Intrinsically disordered domain, transactivation domains, and DNA binding domain are crucial for SP1 condensation and SP1 activity

结构域删除实验显示IDR、TADs和DBD对SP1凝聚和转录激活必不可少，ΔS/T2突变体能与非G4 DNA凝聚，提示S/T2结构域可能抑制非特异性凝聚。ΔS/T2表达细胞的CFP信号增强126%，证实S/T2的调控作用。

RNA G4 regulates SP1-dependent transcription by modulating SP1 condensation

发现Bcl3转录本含G4形成RNA(18nt，QGRS=40)。低浓度RNA促进而高浓度溶解SP1凝聚体，G4 RNA效果更强。报告基因实验显示25nM G4 RNA即显著抑制转录，突变G4 RNA则影响轻微，证实RNA G4的负反馈调控。

研究结论与讨论部分指出，该工作建立了G4-SP1-转录调控的新范式：Bcl3启动子G4促进SP1结合和相分离，招募MED1和Pol II形成转录活性凝聚体；而转录产生的RNA G4则通过浓度依赖性方式调节SP1凝聚，形成负反馈环。这一发现具有多重意义：1) 阐明了G4结构调控基因表达的新机制；2) 揭示了SP1在癌症中过度激活的结构基础；3) 为靶向SP1凝聚体的抗癌药物设计提供新思路，特别是针对其DBD结构域；4) 展示了核酸二级结构在相分离调控中的双向作用。研究还提出SP1可能通过类似机制调控其他致癌基因(如IGF1R、hTERT)，为理解癌症转录组调控提供了新视角。