小鼠淋巴瘤试验中单萜类物质耗竭的定量分析、影响及缓解策略研究

本研究针对体外毒性测试中挥发性物质（如单萜类）因挥发或吸附导致的生物可利用度下降问题，通过建立无顶空（HS-free）孵育体系并结合固相微萃取（nd-SPME）技术，量化了(R)-(+)-柠檬烯（RLIM）、β-月桂烯（βMYR）等物质的游离浓度（cfree）。研究发现HS-free体系显著提高挥发性基因毒素（如1-溴丙烷）的检测灵敏度，同时证实单萜类无致突变性，为其安全性评估提供了新方法学支持。

　　

在食品添加剂和芳香工业中，单萜类物质如(R)-(+)-柠檬烯（RLIM）和β-月桂烯（βMYR）因其天然来源和广泛应用备受关注。然而，这些物质的挥发性（log K_AW>-4）和高脂溶性（log K_OW>3）可能导致体外毒性测试中浓度耗竭，从而低估其潜在风险。传统小鼠淋巴瘤试验（MLA）依赖名义浓度（c_nominal），但挥发、血清蛋白结合等过程会使生物有效剂量（BED）与假设值严重偏离。如何准确量化实际暴露浓度，成为评估这类“难测试化学品”毒性的关键挑战。

为攻克这一难题，Tobias Karl Jochum团队在《Food and Chemical Toxicology》发表研究，通过创新实验设计结合分析技术，系统评估了单萜类在MLA中的浓度耗竭机制。研究采用无顶空孵育体系（HS-free）抑制挥发，并运用直接浸入式非消耗性固相微萃取（nd-SPME）技术，首次实现了含血清培养基中游离浓度的动态监测。实验以1-溴丙烷（1-BP）作为阳性对照，验证方法对挥发性基因毒素的检测效能。

关键技术方法

1. 1.

   HS-free孵育体系：使用完全填充的10 mL顶空瓶，通过隔垫注射避免挥发，对比传统50 mL离心管孵育。

2. 2.

   nd-SPME分析：采用碳宽范围/聚二甲基硅氧烷（CWR/PDMS）纤维，测定c_free并计算血清结合率。

3. 3.

   双浓度指标量化：通过顶空气相色谱-质谱（HS-GC-MS）监测总浓度（c_total），结合AUC评估暴露稳定性。

研究结果

3.1. 小鼠淋巴瘤试验

HS-free体系使RLIM和βMYR的细胞毒性阈值从250 μM降至100 μM，而1-BP的致突变性检测灵敏度提高5倍（GEF阈值从7500 μM降至1500 μM）。单萜类在所有条件下均未显示致突变性（IMF<126×10^-6）。

3.2. 总浓度分析

传统孵育中，RLIM和βMYR在30分钟内挥发90%以上，而HS-free体系维持c_total>80%达4小时。LIN因较低挥发性（log K_AW=-2.71）受影响较小。

3.3. 游离浓度测定

nd-SPME揭示RLIM和βMYR在5%马血清中63-67%被结合（c_free/c_nominal=33-37%），而LIN和1-BP游离比例>90%。血清介导的被动给药（SMPD）补偿了孵育期间的浓度损失。

结论与意义

该研究首次在MLA中整合HS-free孵育与nd-SPME技术，解决了挥发性物质测试的三大难题：

1. 1.

   暴露控制：HS-free体系将RLIM的AUC从<10%提升至78-95%，显著增强实验重现性。

2. 2.

   毒性机制解析：证实单萜类的血清结合主导其生物可利用度，而挥发是传统假阴性的主因。

3. 3.

   安全性再评估：在优化暴露条件下，RLIM、βMYR和(±)-芳樟醇（LIN）均无基因毒性，为其法规豁免提供数据支撑。

这项研究为OECD指南中“难测试化学品”的体外评估提供了标准化模板，其HS-free设计可拓展至TK6细胞等其他悬浮模型，而nd-SPME技术为蛋白结合研究开辟了新途径。未来，结合代谢活化体系的HS-free方法开发，或将进一步揭示单萜类在生物转化过程中的毒性演变规律。