古菌RNA剪接内切酶(ARMAN-2 VSEN)的结构基础揭示底物多样性机制与功能进化

本研究针对古菌RNA剪接内切酶(VSEN)底物识别机制不清的科学问题，通过解析ε2型ARMAN-2 VSEN与BHB RNA复合物的1.8?晶体结构，首次揭示了ARMAN特异性环(ASL)通过保守酪氨酸(Y160)和赖氨酸(K161)稳定RNA凸起区域并定向切割位点的分子机制。该研究阐明了ASL在底物结合和切割中的关键作用，并通过与Crenarchaeal VSENs及真核TSEN复合物的比较分析，发现了跨生命域的功能趋同现象，为理解RNA剪接内切酶的进化与功能多样性提供了重要结构基础。

　　

在生命演化的长河中，RNA剪接机制如同精密的分子剪刀，负责修剪RNA分子中多余的"枝叶"——内含子。这项古老而保守的生物学过程在真核生物和古菌中均扮演着关键角色，但其执行者却展现出惊人的多样性。古菌中的RNA剪接内切酶(VSEN)以其卓越的底物适应性著称，能够识别并切割多种RNA二级结构，包括经典的凸起-螺旋-凸起(BHB)基序及其变体。然而，这种广泛底物特异性的结构基础长期笼罩在迷雾中，成为困扰研究人员的重要科学问题。

更令人困惑的是，古菌tRNA基因的内含子呈现出令人眼花缭乱的多样性——它们不仅存在于典型的位置，还分布在D臂、T臂和受体茎等非常规区域，甚至出现了分裂tRNA、重排tRNA和多内含子tRNA等特殊形式。这种内含子结构的多样化暗示着古菌进化过程中可能发生了显著的功能创新，而VSEN的底物灵活性很可能与之协同进化。尽管先前研究已鉴定出Crenarchaea特异性环(CSL)等结构元件可能参与底物识别，但这些环状结构如何精确调控酶活性和底物选择性的分子细节仍不清楚。

为了揭开这一谜团，由Akira Hirata领衔的研究团队将目光投向了一种特殊的ε₂型VSEN——来自超小古菌Candidatus Micrarchaeum acidiphilum的ARMAN-2。选择这一研究对象颇具战略眼光：一方面，ARMAN-2 VSEN含有一个独特的ARMAN特异性环(ASL)，其功能尚未明确；另一方面，ε₂型VSEN代表了古菌RNA剪接内切酶家族中最复杂的亚型之一，由α^N-α-β^C三个结构单元融合而成，可能蕴藏着理解功能进化的关键线索。

研究人员采用X射线晶体学技术解析了ARMAN-2 VSEN与合成BHB RNA复合物的高分辨率结构，结合系统的生化分析，揭示了ASL在底物识别和催化中的核心作用。这项发表在《Nucleic Acids Research》上的工作不仅阐明了古菌VSEN广谱底物特异性的结构基础，还通过跨生命域的比较分析，发现了古菌与真核生物RNA剪接内切酶在功能机制上的惊人趋同，为理解这一关键酶类的分子进化提供了全新视角。

关键技术方法包括：1) 在大肠杆菌中表达带有C端组氨酸标签的重组ARMAN-2 VSEN，通过镍柱亲和层析和肝素柱层析进行纯化；2) 合成含2'-脱氧尿苷(dU14)的21-mer BHB RNA双链体用于复合物结晶；3) 采用悬滴气相扩散法获得晶体，在日本SPring-8同步辐射光源BL38B1线站收集1.8?分辨率X射线衍射数据；4) 通过分子置换解析结构，使用Phaser进行相位确定，Coot进行模型构建，Refmac5进行精修；5) 设计ASL点突变体(Y160A/F、K161A/R等)和缺失突变体(ΔASL)，通过体外切割实验分析酶活变化。

整体结构揭示ASL-RNA相互作用网络

通过解析1.8?分辨率的晶体结构，研究人员首次捕捉到ε₂型VSEN与RNA底物的"亲密接触"。结构显示，两个ε原体通过保守的β-β相互作用和L10环接触形成功能性同源二聚体，RNA双链体则横跨二聚体表面中央结合。引人注目的是，ASL直接与RNA的凸起区域相互作用，通过保守的Y160和K161残基帮助定向切割位点磷酸基团。这一发现为理解VSEN如何适应多样化的RNA结构提供了直接的结构证据。

2型VSEN同源二聚体与RNA双链体的结合模式；(C)ε₂型VSEN同源二聚体示意图，标注关键结构特征。'>

RNA识别与切割的分子细节

对结合界面的精细分析揭示了VSEN如何精确识别BHB基序并催化内含子切除。研究发现，凸起区域的首个核苷酸A13通过π-阳离子相互作用被R275和W384"夹住"，而K228与dU14的磷酸基团形成氢键，共同稳定RNA的弯曲构象。尤为关键的是，ASL中的K161与dU14的核糖O4'和C17的磷酸基团形成氢键网络，如同"分子支架"般固定切割位点的几何构型。催化三联体Y236、H251和K282则围绕切割位点磷酸基团排布，展现出与RNase A相似的催化机制。

ASL功能验证与结构比较

通过系统的突变分析，研究人员证实ASL对酶活性的关键作用：Y160A和K161A突变几乎完全废除切割活性，而保守性突变Y160F和K161R保留部分活性。与AFU α'₂型VSEN的结构比较揭示，虽然两者催化核心保守，但ARMAN-2 VSEN通过ASL实现了更灵活的底物识别。这种结构差异解释了为何ε₂型VSEN能处理更广泛的RNA底物，而α'₂型仅限于经典BHB基序。

跨生命域的功能趋同

令人惊叹的是，与真核TSEN复合物的比较显示，TSEN2亚基中的真核特异性环(ESL)占据了与ASL类似的空间位置，暗示两者可能通过趋同进化获得了相似的RNA定位策略。这一发现将古菌与真核生物的RNA剪接机器在分子水平上联系起来，为理解它们的共同进化起源提供了重要线索。

这项研究通过高分辨率结构解析与功能分析，建立了VSEN广谱底物识别的机制模型，揭示了ASL在RNA定位和催化中的双重作用。研究不仅阐明了古菌RNA剪接内切酶功能进化的结构基础，还通过发现ASL、CSL和ESL的功能趋同，展现了生命在分子水平上的精巧适应策略。这些发现对于理解RNA处理机器的分子进化具有重要意义，也为相关人类疾病(如脑桥小脑发育不全)的研究提供了新的视角。该工作标志着我们对古老RNA剪接机制的认识迈出了重要一步，为未来设计靶向RNA处理通路的新型干预策略奠定了理论基础。