猪脾脏红髓巨噬细胞的磁激活分选技术优化与功能表征研究

本研究通过对比CD163抗体分选与磁激活分选（MACS）技术，建立了基于红髓巨噬细胞（RPMs）铁代谢特性的无抗体高效分离方案。研究发现MACS法可富集81%的自发荧光CD163+细胞，显著优于抗体法（71.8%），且细胞高表达CD16/CD163、低表达CD14/CD32，具备强吞噬衰老红细胞（RBCs）能力及铁代谢相关基因（HMOX-1/FTH1）上调特征，为脾脏免疫研究与铁稳态机制探索提供新工具。

　　

1 Introduction

脾脏作为血液过滤器，其红髓巨噬细胞（RPMs）通过清除衰老红细胞（RBCs）和回收铁元素维持机体铁稳态。猪与人类脾脏解剖结构高度相似，但现有猪RPMs分离方法存在效率低、成本高等问题。本研究创新性地利用RPMs铁沉积特性产生的磁性与自发荧光标志，开发了无需抗体的磁激活分选（MACS）技术，并与传统CD163抗体分选法进行系统性对比。

2 Materials and methods

实验采用三基因敲除（TKO）猪脾脏组织，通过机械分散获得单细胞悬液后，平行进行两种分选：

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  CD163抗体法：使用抗猪CD163单抗与微珠标记后经MACS柱分选

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  磁性富集法：直接利用RPMs铁含量导致的磁性通过LS分选柱捕获

分选后细胞通过流式细胞术检测CD11b/CD14/CD16/CD32/CD163/CD169表达，普鲁士蓝染色验证铁沉积，并采用钙黄绿素标记的衰老RBCs进行吞噬实验。基因层面通过qPCR分析NENF（神经分泌蛋白）、HMOX-1（血红素加氧酶-1）和FTH1（铁蛋白重链）表达。

3 Results

3.1 分选效率对比

初始脾细胞中14.7%具自发荧光（RPMs特征），而PBMCs完全阴性。CD163抗体法分选后CD163⁺纯度达90%，但仅71.8%为自发荧光；磁性法则直接富集81%自发荧光细胞，且93%表达CD163。阳性组分呈现典型铁锈色，普鲁士蓝染色与Amplex UltraRed检测均证实高铁含量。

3.2 表型特征

猪RPMs呈现与人类高度一致的标记谱：

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  高表达：CD16（FcγRIII）、CD163（血红蛋白清道夫受体）

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  中度表达：CD11b（整合素αM）

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  低/阴性：CD14（LPS受体）、CD32（FcγRII）、CD169（唾液酸受体）

3.3 功能验证

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  吞噬功能：磁性分选RPMs对6月龄衰老RBCs的吞噬活性显著高于新鲜RBCs（p<0.01）

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  基因表达：HMOX-1和FTH1表达量较阴性组分上调3-5倍（p<0.001），而免疫调节因子NENF下调2倍

4 Discussion

磁性分选法凭借铁代谢这一RPMs核心生物学特性，实现了更高性价比的分离效果。该方法规避了抗体批次差异问题，且操作时间缩短40%。分选细胞表现出典型"铁匠细胞"形态与功能：

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  铁循环：通过HMOX-1/FTH1通路高效降解血红素并储存铁

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  免疫调控：CD16^hiCD32^lo特征支持Fcγ受体介导的靶向吞噬

研究局限性在于未解析CD163⁺非自发荧光亚群的性质。未来可通过单细胞测序进一步揭示猪RPMs异质性。本方案为大型动物脾脏免疫研究、贫血/铁过载疾病模型构建及跨物种比较提供了关键技术支撑。

（注：全文严格依据原文数据，未添加非文献记载内容；专业术语如MACS、RPMs等均按原文格式标注；上标下标使用^{/_{规范呈现）}}