基于iTLR4生物发光共振能量转移技术实时解析TLR4配体依赖性构象动态及其在先天免疫调控中的突破性发现

这篇研究开创性地开发了基于生物发光共振能量转移（BRET）的iTLR4检测技术，首次实现活细胞内Toll样受体4（TLR4）配体诱导的实时构象动态监测。该技术揭示LPS（脂多糖）通过稳定TLR4单体胞内域相互作用（EC50=660 EU/mL）激活信号，并发现功能拮抗剂LPS-RS、TAK-242和（+）-纳洛酮在受体水平存在显著机制差异：LPS-RS完全抑制BRET信号，TAK-242部分抑制，而（+）-纳洛酮反常增强信号却阻断IL-8分泌。研究还首次报道CD14/MD2辅助蛋白对纳洛酮立体异构体活性的调控作用，为TLR4相关疾病治疗提供全新靶点。

　　

引言

Toll样受体4（TLR4）作为先天免疫系统的核心病原体识别受体，其非经典功能已拓展至疼痛、成瘾等生理病理过程。传统研究方法依赖NFκB转位、IL-8分泌等下游指标，无法捕捉信号起始阶段的受体动态。本研究突破技术瓶颈，开发出iTLR4检测平台，通过将纳米荧光素酶（Nluc）和Venus荧光蛋白分别标记TLR4 C端，实现配体依赖性TLR4-TLR4相互作用的实时监测。

材料与方法

实验采用HEK293细胞系，构建HA-TLR4-Venus和HA-TLR4-NLuc融合蛋白，辅以CD14/MD2共转染。BRET检测中，LPS刺激后记录475 nm（供体）和535 nm（受体）发光值，计算BRET比率（×1000）。免疫荧光验证NFκB核转位，ELISA检测IL-8分泌。统计学分析采用GraphPad Prism进行混合效应模型及多重比较检验。

功能性验证

TLR4-Venus/NLuc转染细胞经LPS刺激后，NFκB在15分钟即出现核转位（图1H），而IL-8分泌需240分钟才显著升高（p<0.0001）。关键发现是：LPS诱导的BRET信号呈时间依赖性增长（图2E），且严格依赖CD14/MD2存在（p<0.0001），而TLR2激动剂Pam3CSK4无此效应（p=0.87），证实技术特异性。

拮抗剂机制解析

三大拮抗剂展现迥异特性：

1. 1.

   LPS-RS：完全抑制BRET信号（IC₅₀=75 ng/mL）和IL-8分泌，符合经典竞争性拮抗特征。

2. 2.

   TAK-242：仅部分抑制BRET信号（30%），但完全阻断IL-8分泌，提示其作用于TLR4胞内TIR域（Cys747）干扰信号传导而非完全阻止二聚化。

3. 3.

   （+）-纳洛酮：10 μM即可诱导BRET信号（EC₅₀=4.2 μM），且信号在缺失CD14时增强2倍（图5D），但 paradoxically抑制IL-8分泌，暗示其将TLR4锁定在"关闭构象"。

立体异构体差异

（-）-纳洛酮活性更强（EC₅₀=3.0 μM），且MD2缺失使其信号增强（p=0.001），而（+）-异构体不受MD2影响。阿片受体BRET实验证实（-）-异构体特异性抑制DAMGO诱导信号（p=0.005），排除了化合物失活可能。

讨论与展望

iTLR4技术首次揭示TLR4存在多构象状态：LPS促进"开放构象"激活信号，（+）-纳洛酮诱导"刚性闭合构象"阻断下游通路。该技术突破传统终点检测局限，可用于：

1. 1.

   高通量筛选TLR4特异性调节剂

2. 2.

   解析辅助蛋白（如LBP）对受体动态的调控

3. 3.

   开发针对脓毒症、慢性炎症的精准疗法

   未来需优化稳定转染细胞系，并探索更多配体（如Eritoran）对受体构象的影响。这项研究为先天免疫受体机制研究树立了新范式。