一种从多种人体体液中高效分离小细胞外囊泡的标准化方法及其在生物标志物发现中的应用

本研究针对小细胞外囊泡(sEVs)分离方法缺乏标准化的问题，开发了一种基于超速离心技术的通用流程，可从1mL血浆、2mL唾液和10mL尿液中高效分离sEVs。通过TEM/SEM形貌观察、NTA粒径分析和Western blotting标志物检测验证了方法的可靠性，并运用质谱技术鉴定出血浆(545种)、唾液(198种)和尿液(507种)sEVs蛋白。该方法为临床生物标志物发现提供了标准化工具，具有操作简便、成本低廉和重复性好的特点。

　　

在生命科学和医学研究领域，小细胞外囊泡(small extracellular vesicles, sEVs)正成为炙手可热的研究对象。这些直径30-150纳米的"细胞信使"携带着蛋白质、脂质和核酸等重要生物分子，在细胞间通讯中扮演关键角色。更令人兴奋的是，sEVs在不同生理和病理条件下的特征变化，使其成为疾病机制研究、早期诊断标志物发现和靶向治疗的"明星分子"。然而，这个充满希望的研究领域却面临着一个基础性挑战——缺乏标准化的sEVs分离方法。

目前研究者们面临三大困境：首先，不同实验室采用的分离技术（如超速离心、尺寸排阻色谱、免疫捕获等）导致研究结果难以比较；其次，生物样本的个体差异（年龄、性别、健康状况等）和样本特性（pH值、离子强度等）显著影响sEVs的产量和纯度；最重要的是，临床常用体液（如血液、唾液和尿液）的sEVs分离尚未建立统一方案，这严重阻碍了sEVs在临床转化中的应用。正是为了解决这些关键问题，Pratibha Sharma和Rajinder K.Dhamija在《BMC Methods》上发表了他们的创新性研究。

研究人员开发了一套基于超速离心的标准化流程，可同时处理血浆、唾液和尿液三种临床常见体液。关键技术包括：1）差异离心结合0.22μm过滤的预处理；2）优化超速离心参数（120,000g，2h，4°C）；3）蔗糖密度梯度纯化（1M/1.4M/1.8M）；4）综合使用透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)和纳米颗粒追踪分析(NTA)进行表征；5）Western blotting检测CD-9、CD-63等标志物；6）质谱蛋白质组学分析。研究选用健康志愿者样本（3人份血浆、唾液和尿液），所有操作均通过伦理审查。

电子显微镜分析

通过TEM观察到三种来源sEVs均呈现典型杯状形态，平均尺寸115±30nm。SEM显示血浆sEVs（76±52nm）分散性最好，唾液sEVs（120±7nm）呈现聚集倾向，尿液sEVs（150±8nm）尺寸最大。免疫电镜证实TSG101和Flotillin1标志物的存在。

纳米颗粒追踪分析

NTA检测显示血浆sEVs浓度最高（2.7×10¹¹颗粒/mL），尺寸140±78nm；唾液和尿液sEVs浓度相当（约1.5×10¹⁰颗粒/mL），尺寸分别为174±70nm和170±79nm。与电镜结果差异反映液体环境中布朗运动的影响。

蛋白质分析

SDS-PAGE显示尿液sEVs含更多高分子量蛋白。Western blotting明确检测到TSG101、Flotillin1等外泌体标志物，而内质网标志物Calnexin呈阴性，证实分离纯度。质谱鉴定出545种血浆sEVs蛋白、198种唾液sEVs蛋白和507种尿液sEVs蛋白，其中70%在Vesiclepedia数据库中有记载。

RNA分析

采用商业试剂盒成功提取sEVs总RNA，为后续微小RNA研究奠定基础。

这项研究建立了首个适用于多种体液的sEVs标准化分离方案，解决了该领域的方法学瓶颈。其创新性体现在三方面：1）临床实用性——所需样本量小（1mL血浆），适合常规检测；2）技术普适性——仅需常规超速离心设备，便于推广；3）数据可靠性——多模态表征确保结果可信度。特别值得注意的是，该方法无需预先去除高丰度血浆蛋白即可获得优质质谱数据，这显著简化了蛋白质组学分析流程。

从转化医学角度看，该研究具有深远意义：首先，为液体活检提供了标准化工具，尤其适用于癌症、神经退行性疾病等领域的生物标志物发现；其次，建立的方法学框架可扩展至脑脊液、乳汁等其他体液；最后，研究揭示的体液间sEVs特性差异（如唾液sEVs的聚集倾向）为理解其生物学功能提供了新线索。正如作者强调的，这项技术将推动"多组学整合分析"在精准医学中的应用，使通过非侵入性样本实现疾病早期预警成为可能。

未来研究可沿三个方向拓展：1）在更大队列中验证方法的稳定性；2）探索不同疾病状态下sEVs特征谱变化；3）开发基于该技术的自动化诊断设备。随着这些工作的推进，sEVs有望从实验室走向临床，真正成为"细胞水平"的诊断治疗利器。