实时可视化STAT激活的基因编码生物传感器：揭示免疫调控新机制与药物开发新策略

本研究针对JAK-STAT信号通路监测技术瓶颈，开发了基于FLIM-FRET的STATeLight系列生物传感器。研究人员通过创新性地将荧光蛋白mNeonGreen/mScarlet-I标记STAT5A核心片段，首次实现活细胞中STAT5二聚化过程的实时动态监测。该技术不仅能精准区分野生型与疾病相关突变体（如Y694F/S710F），还可用于JAK抑制剂（如upadacitinib）的高通量筛选，为癌症、自身免疫病等STAT相关疾病的机制研究和药物开发提供了革命性工具。

　　

在免疫学和细胞生物学领域，STAT（信号转导和转录激活因子）家族蛋白如同细胞内的"信息中转站"，负责将细胞外信号（如细胞因子）传递至细胞核内调控基因表达。其中STAT5作为JAK-STAT通路的核心成员，其异常激活与白血病、自身免疫疾病等多种重大疾病密切相关。然而长期以来，科学家们面临一个关键技术瓶颈——缺乏能在活细胞中实时监测STAT激活状态的工具。传统方法如磷酸化抗体染色需要固定细胞，而报告基因系统则存在时间分辨率低、易受干扰等缺陷。这一技术短板严重制约了STAT调控机制研究和靶向药物开发。

为突破这一困境，Thi A.N. Nguyen和Roman Meledin等研究团队在《Nature Chemical Biology》发表创新成果。研究人员巧妙结合计算结构生物学与先进成像技术，开发出名为STATeLight的基因编码生物传感器。通过AlphaFold预测STAT5A二聚体构象，筛选最佳荧光蛋白标记位点；采用荧光寿命成像显微镜（FLIM）监测荧光共振能量转移（FRET）效率变化，建立了一套活细胞中STAT激活的实时监测系统。研究还利用人原代CD4⁺T细胞验证技术应用价值，并对16种JAK抑制剂进行功能评估。

【生物传感器设计】

研究首先通过AlphaFold模拟STAT5A平行/反平行二聚体的空间构型，发现C端SH2结构域在激活过程中距离变化最显著。将mNeonGreen（mNG）和mScarlet-I（mSC-I）分别标记STAT5A核心片段（CF）C端，构建的STATeLight5A在IL-2刺激下表现出12%的FRET效率变化，远优于N端标记方案（变异体4 vs 变异体1-3）。该设计特异性捕捉STAT5从反平行（非活性）到平行（活性）二聚体的构象转变，避免磷酸化单体产生的干扰信号。

【突变体功能解析】

利用STATeLight5A平台，研究人员系统分析了STAT5A功能获得型（GOF）和功能缺失型（LOF）突变体。SH2结构域关键位点突变（如Y694F）完全阻断IL-2诱导的二聚化（p=0.368），而S710F突变体则表现出持续激活特性（p=4.35×10^-11）。特别值得注意的是，癌症相关STAT5B突变体N642H在无刺激条件下即显示二聚化倾向，且对PTPN1介导的去磷酸化具有显著抗性（p=1.25×10^-14），这为理解STAT5致癌机制提供了新视角。

【药物筛选应用】

在抑制剂筛选中，STATeLight5A展现出卓越的药物评价能力。SH-4-54能完全抑制STAT5二聚化（p<1×10^-15），而临床常用JAK抑制剂upadacitinib（0.8μM）可阻断80%的STAT5激活（p=0.014）。通过实时监测发现，不同抑制剂作用动力学存在显著差异——filgotinib作用迅速但持续时间短，而upadacitinib表现出持续抑制效应。这种时间分辨的药效评估为精准用药提供了重要参考。

【原代细胞验证】

研究最后成功将STATeLight5A应用于人原代CD4⁺T细胞，首次实现天然免疫细胞中STAT5激活的实时观测。IL-2刺激5分钟内即可检测到STAT5二聚化，70分钟达到峰值。该技术对临床样本分析具有重要意义，如可评估患者T细胞对JAK抑制剂的敏感性差异（tofacitinib处理组p=0.837 vs 未处理组p=0.004）。

这项研究开创性地建立了STAT蛋白活化的实时监测体系，其技术优势体现在三个方面：一是直接检测二聚化构象变化，避免磷酸化抗体的假阳性；二是时间分辨率达分钟级，可捕捉动态调控过程；三是适用于高通量筛选，加速药物开发。STATeLight技术不仅为JAK-STAT通路基础研究提供强大工具，更在个性化医疗（如筛选患者特异性治疗方案）和精准药物开发（如评估STAT5靶向化合物）领域展现出广阔应用前景。该成果将推动从"静态检测"到"动态监测"的研究范式转变，为理解免疫调控和疾病机制打开新窗口。