新型双功能Gag-Pol二聚体JLJ648通过激活CARD8炎症小体清除HIV感染细胞的机制研究

研究人员针对HIV-1潜伏库清除难题，开发了基于Gag-Pol二聚化的高通量筛选体系，发现萘基儿茶酚二醚类化合物JLJ648能同时抑制病毒复制（EC50=1.6 nM）并激活CARD8炎症小体（EC50=86 nM）。通过冷冻电镜首次解析出"无限结"状p66同源四聚体结构，揭示NNRTIs通过稳定PR自剪切触发细胞焦亡的新机制，为艾滋病功能性治愈提供新策略。

　　

艾滋病治疗面临的最大挑战是潜伏的HIV-1病毒库难以清除。尽管抗逆转录病毒疗法(ART)能有效控制病毒复制，但一旦停药，潜伏病毒会迅速反弹。这主要是因为HIV-1能将基因组整合到宿主细胞（如CD4⁺ T细胞和巨噬细胞）中形成长期存在的潜伏库。传统ART无法靶向这些"隐身"的病毒库，患者需终身服药。

近年来，"shock and kill"策略成为研究热点——通过激活潜伏病毒再清除感染细胞。有趣的是，某些非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)如利匹韦林(RPV)和依非韦伦(EFV)被发现具有双重功能：既能抑制逆转录酶(RT)活性，又能促进Gag-Pol多聚蛋白二聚化，导致病毒蛋白酶(PR)提前激活并切割宿主蛋白CARD8，从而触发炎症小体介导的感染细胞焦亡。然而，现有NNRTIs的二聚化效率低，且其分子机制不明。

为突破这些限制，Klarissa Hollander等人在《npj Drug Discovery》发表研究，开发了新型双功能抑制剂JLJ648。该化合物来自优化的萘基儿茶酚二醚系列，不仅具有皮摩尔级抗病毒活性，还能高效诱导Gag-Pol二聚化（EC₅₀=95 nM）。研究人员首先构建了THP-1细胞高通量筛选模型，通过诱导表达HIV-1 Gag-Pol和CARD8，从758个NNRTIs中筛选出8个强效焦亡诱导剂。其中JLJ648表现突出，其细胞焦亡效应可被蛋白酶抑制剂洛匹那韦(LPV)阻断，证实依赖PR活性。

研究采用多项关键技术：1）建立原代CD4⁺ T细胞感染模型评估化合物清除效率；2）均相时间分辨荧光(HTRF)检测p66同源二聚化；3）X射线晶体学解析JLJ648与p66/p51异源二聚体复合物结构（2.4 ?）；4）冷冻电镜(cryo-EM)首次捕获p66同源四聚体"无限结"结构（3.4 ?）；5）尺寸排阻色谱-多角度激光散射(SEC-MALS)和质谱光度法验证溶液状态下的寡聚化现象。

研究结果揭示多个重要发现：

A HTS细胞筛选体系

构建的THP-1 clone 14细胞系能特异性响应NNRTIs（如5 μM JLJ648引起70%细胞死亡），且该效应严格依赖CARD8表达和PR活性。比较三种结构类似物发现，萘环和4-硫尿嘧啶是焦亡活性的关键，JLJ648的活性比JLJ555强37倍。

结构机制研究

冷冻电镜解析出两种JLJ648结合形式：经典NNRTI结合位点的p66/p66'同源二聚体（3.1 ?）和全新的同源四聚体。四聚体中心存在未建模的电子密度，推测为两个JLJ648分子通过π-π堆积形成的二聚体，周围环绕四个p66催化亚基。K259A突变体实验证实，四聚体界面残基的突变虽不影响二聚化（HTRF显示EC₅₀无差异），但使焦亡效率降低30%，说明四聚体形成可能促进PR自剪切。

功能验证

SEC-MALS显示JLJ648使RT分子量从110 kDa（二聚体）增至264 kDa（四聚体）。质谱光度法证实JLJ648处理组中二聚体占比达80%，而apo RT仅26%。在K259A突变病毒中，EFV、JLJ648和JLJ600的焦亡效应均减弱，印证四聚体的生理重要性。

这项研究首次阐明NNRTIs通过稳定RT四聚体增强Gag-Pol二聚化的分子机制。与传统仅靶向成熟RT异源二聚体的药物不同，JLJ648能同时作用于未切割的Gag-Pol多聚蛋白，通过"双靶点"策略——抑制病毒复制和清除感染细胞，为根治艾滋病提供新思路。该发现不仅拓展了对RT寡聚化调控的认知，还为设计下一代"shock and kill"药物提供了结构模板。尤其值得注意的是，PR的保守性使该策略对所有HIV-1亚型有效，有望克服现有疗法面临的耐药难题。