胶原支架各向异性与静态张力协同维持体外培养中人肌腱细胞表型的研究

推荐：为解决肌腱损伤修复中细胞表型维持难题，研究人员通过调控胶原支架弹性（4SP交联）、表面拓扑结构（平面/沟槽）和机械刺激（静态/循环张力），发现0.5 mM 4SP交联的沟槽支架联合静态张力可最优维持人肌腱细胞定向排列及SCX、ELN等标志物表达，为肌腱工程提供多因素协同调控新策略。

　　

肌腱损伤是全球肌肉骨骼系统最常见的伤病之一，仅美国每年相关医疗支出就超过8740亿美元。目前临床首选的组织移植物虽能模拟天然肌腱结构，却常导致修复组织紊乱和再断裂。组织工程领域正尝试通过仿生支架和微环境调控开发功能性替代物，但单一生物物理信号（如仅机械刺激或仅拓扑引导）的局限性日益凸显——例如各向异性结构可能诱发肌腱细胞异常分化为软骨或骨细胞。

在这项发表于《Biomaterials and Biosystems》的研究中，Ignacio Sallent团队创新性地将三种关键生物物理因素（支架弹性、表面拓扑和机械张力）进行系统组合，首次探究其对原代人肌腱细胞功能的协同影响。研究选用猪跟腱来源的I型胶原，通过软光刻技术制备平面/沟槽（2 μm规格）支架，采用4臂聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯（4SP）进行梯度交联（0-1.5 mM），并通过定制化生物反应器施加静态/循环机械刺激（5%应变，0.5 Hz）。

关键技术包括：1）通过电泳和能谱分析验证胶原纯度；2）原子力显微镜（AFM）定量表征微观拓扑；3）微压痕技术测定局部弹性模量；4）多区域共聚焦成像分析细胞/基质取向；5）qPCR检测10种肌腱相关基因表达。研究使用3例人肌腱来源细胞（附表中注明伦理许可号CA 1046），所有实验在P4代细胞完成。

3.1 胶原支架特性

电泳显示典型I型胶原条带，AFM证实4SP交联显著提升沟槽高度（0.57→1.11 μm）和机械性能（杨氏模量1.2→3.7 MPa），0.5 mM即达交联饱和点。有趣的是，交联后表面微结构更清晰，可能因刚度增加减少了图案变形。

3.3 细胞行为调控

DNA定量显示1.5 mM 4SP显著抑制增殖，但0.5 mM沟槽支架在第10天促进细胞生长（较平面组增加37%）。形态学分析揭示：交联沟槽支架诱导最强的细胞核定向（较非交联组提高2.1倍）和长径比（1.8倍），而平面组无此效应。

3.5 基质重塑特征

静态张力下，交联沟槽支架的tenascin C沉积量较对照组提升65%，且胶原III排列最有序（相干性0.82 vs 平面组0.31）。基因表达显示：静态张力特异性上调SCX（4.3倍）和ELN（3.1倍），而循环张力意外激活SOX9（2.7倍）和COL5A1（3.5倍）。

4.4 机械刺激机制

静态张力使沟槽支架细胞取向度达峰值（较无张力组提高58%），而循环张力导致胶原III沉积增加但排列紊乱。作者推测短期循环刺激可能模拟损伤微环境，触发修复反应而非稳态维持。

这项研究首次阐明：低刚度（50-135 kPa）沟槽胶原支架与静态张力的组合，能最有效维持人肌腱细胞的表型和基质定向组装。其创新性在于：1）明确4SP交联对微观拓扑的增强效应；2）揭示静态张力在抑制异位分化（SOX9/BGLAP未检出）方面的优势；3）建立多参数（形态/蛋白/基因）功能评估体系。尽管仍需验证长期培养效果，该工作为开发仿生肌腱移植物提供了关键设计原则——即应协同调控物理微环境的各向异性和静态力学信号，而非传统单一因素策略。这些发现不仅适用于肌腱修复，对韧带、角膜等取向敏感组织的工程化构建也有重要借鉴价值。