自然杀伤细胞来源纳米囊泡与细胞外囊泡的细胞毒性、内化及抗癌药物递送功效比较研究

本研究创新性地通过挤压法高效制备自然杀伤细胞来源纳米囊泡（NK-NVs），与超速离心法获得的细胞外囊泡（NK-EVs）相比，产量提升402倍且保留关键生物标志物（Alix/TSG101/CD9）。研究发现NK-NVs通过小窝蛋白介导的内化途径选择性杀伤肿瘤细胞，并成功构建pH敏感性阿霉素载药系统（NK-NVs-DOX），在酸性肿瘤微环境中释放效率提升30%，为肿瘤免疫治疗提供了可规模化生产的新型递送平台。

　　

自然杀伤细胞衍生纳米囊泡的突破性制备与应用

产量与表征的革命性提升

通过挤压法（extrusion）制备的自然杀伤细胞纳米囊泡（NK-NVs）展现出惊人的规模化生产潜力。与传统的超速离心法（ultracentrifugation）相比，单次制备可获得4.11×10¹⁴颗粒，粒子产量提升402.18倍，蛋白质收获量增加325.76倍。透射电镜（TEM）显示其保持典型脂质双分子层结构，粒径78±29.8 nm，且稳定表达外泌体标志物Alix、TSG101和CD9。值得注意的是，-80°C储存28天仍能维持粒径稳定，解决了临床转化中的量产瓶颈。

独特的延迟杀伤机制

Western blot证实NK-NVs携带穿孔素（perforin）和颗粒酶B（granzyme B）等细胞毒性效应分子，但杀伤动力学呈现显著延迟——24小时杀伤效率仅为NK-EVs的50%，48小时才达到同等效果。蛋白质组学分析揭示其含有7,366种与亲本NK细胞相同的蛋白（较NK-EVs多2,040种），特别是内质网伴侣蛋白BiP表达量显著升高。这种独特的"慢杀伤"特性与其通过小窝蛋白（caveolin）介导的内化途径相关：甲基-β-环糊精（MβCD）预处理可使SKOV3卵巢癌细胞对NK-NVs的摄取率降低63%，细胞毒性下降41%。

智能药物递送系统构建

采用挤压法优化的阿霉素载药系统（NK-NVs-DOX）展现出卓越性能：

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  载药效率达37.68±4.42%，远超共孵育法（18.60±4.71%）

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  在pH 5.5模拟肿瘤微环境时，药物释放量较生理pH 7.4条件提高30%

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  对四种癌细胞系（SKOV3/COC1/DDP/A2780/Panc-1）的杀伤效果较游离DOX提升2.1-3.8倍

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  4°C储存28天仍保持90%以上载药稳定性

临床转化的双轨价值

该研究同时揭示了NK-NVs的双重应用前景：作为独立的"无细胞免疫疗法"，其选择性杀伤特性（对正常卵巢上皮细胞IOSE80无显著毒性）规避了传统NK细胞治疗的宿主排斥风险；作为药物载体，其EPR效应（enhanced permeability and retention）与pH响应性释放特性，为克服肿瘤耐药性提供了新思路。特别是对顺铂耐药卵巢癌细胞COC1/DDP，NK-NVs-DOX可诱导22%的细胞凋亡（Annexin V⁺/PI⁺），显著高于空白对照组的10.41%。

未来展望

尽管在胰腺癌细胞Panc-1中效果受限（24小时存活率仍达78%），但该平台技术可通过表面修饰靶向配体进一步优化。研究团队计划开展体内实验，通过尾静脉注射评估NK-NVs-DOX在肿瘤模型中的靶向蓄积能力，这或将开创基于NK细胞囊泡的联合治疗新范式。