深度突变扫描与SPR分选技术联用大规模鉴定抗蓖麻毒素抗体的中和表位

这篇研究通过结合深度突变扫描（DMS）和表面等离子共振（SPR）分选技术，系统鉴定了17种抗蓖麻毒素抗体的结合表位与亲和力特征。研究揭示了抗体靶向RTA/RTB链关键表位（如活性位点αD-helix）与中和能力的关联，发现高亲和力抗体V2G10/V2A11能完全抑制RTA酶活（IC50 <1 nM），而靶向B链1β结构域的RicE4/RicE8则表现出跨亚型交叉反应性。该工作为设计靶向多表位的抗毒素鸡尾酒疗法提供了分子基础。

　　

蓖麻毒素的威胁与抗体治疗挑战

蓖麻毒素作为从蓖麻籽中提取的II型核糖体失活蛋白，由具有酶活性的A链（RTA）和介导细胞摄取的B链（RTB）通过二硫键连接而成。其高毒性（LD₅₀约3 μg/kg）和易获取性使其成为生物恐怖主义的重要工具。尽管抗蓖麻毒素单克隆抗体（mAb）在临床前研究中展现出治疗潜力，但目前尚无获批药物，主要障碍在于需同时中和两种天然亚型（D和E）且表位特异性决定保护效力。

抗体亲和力与表位特征的精准解析

研究团队采用表面等离子共振（SPR）和生物层干涉仪（BLI）对17种抗体（含VHH和IgG）进行系统评估。SPR通过单循环动力学测定发现高亲和力抗体如V2G10对蓖麻毒素D的K_D达50 pM，而BLI因静态检测中的重结合效应更适用于高通量初筛。创新性地对解离相进行对数线性拟合，解决了超低解离速率（k_d <10^?6 s^?1）的测量难题。

表位分选与高分辨率定位的协同策略

通过SPR分选构建了包含289对相互作用的竞争矩阵，网络分析将抗体划分为6个表位簇：3个位于RTA（包括活性位点邻近区、αD-helix区），3个位于RTB（含1β和2γ结构域）。深度突变扫描（DMS）与酵母表面展示（YSD）联用进一步在氨基酸水平验证了表位：

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  活性位点靶向抗体：V2A11/V2G10直接结合RTA催化裂隙，在1:1摩尔比下即可完全抑制腺嘌呤释放（p<0.001）；

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  新型αD-helix表位抗体：RicE5/R18靶向远离活性中心的螺旋结构，虽不抑制酶活，但动物实验显示独特的延迟保护效应；

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  B链交叉反应抗体：RicE4/RicE8结合1β结构域，避开D/E亚型差异区域（如2γ的Tyr²⁴⁸→Phe突变），而RB37因靶向2γ区仅中和D亚型。

抗体格式对表位解析的影响

研究发现Fab片段相比完整IgG能识别更多表位残基（如R18-Fab鉴定21个残基 vs IgG仅16个），揭示二价结合导致的亲合力效应会掩盖边缘相互作用。这为抗体工程提供了重要启示：表位精细作图需采用单价形式。

治疗设计与转化意义

研究明确了表位空间分布与功能的关系：

1. 1.

   中和机制：活性位点抗体通过直接阻断RTA催化作用，而RTB抗体如SylH3（同源表位于1β）通过抑制细胞摄取发挥作用；

2. 2.

   鸡尾酒疗法基础：非重叠表位抗体如V2G10（RTA活性区）与RicE5（αD-helix）可协同阻断毒素不同生命周期；

3. 3.

   诊断应用：RB34/RB37对D亚型的特异性为法医鉴定提供了工具。

该研究建立的"SPR分选+DMS验证"双轨策略，不仅加速了抗毒素抗体的理性设计，也为其他蛋白-抗体互作研究提供了范式。未来需在动物模型中验证多表位抗体的协同效应，并探索αD-helix表位抗体的独特保护机制。