压力辅助毛细管电泳前沿分析技术揭示细胞色素c与适配体的特异性结合机制及其在凋亡标记中的应用

这篇研究采用压力辅助毛细管电泳前沿分析（PACE-FA）技术，结合电泳迁移率校正和非线性曲线拟合方法，首次系统评估了三种细胞色素c（cyt c）适配体（Apt40/Apt61/Apt76）的结合特性。研究发现Apt76具有最高结合常数（1.53×106 M?1）和1:1化学计量比，为凋亡信号检测提供了高特异性分子探针。该研究为区分生物大分子特异性/非特异性结合提供了新方法学范式。

　　

ABSTRACT

细胞色素c（cyt c）作为线粒体膜间隙中的血红素蛋白，其释放是细胞凋亡的关键事件。研究通过PACE-FA技术结合新型电泳迁移率校正模型，定量解析了三种常用cyt c适配体的结合特性。实验采用非线性拟合方程区分特异性与非特异性结合，发现Apt76具有最优结合性能（K_a=1.53×10⁶ M^?1），且所有适配体均呈现1:1化学计量比。荧光滴定实验验证了该方法的可靠性，为生物分子互作研究提供了免标记、高精度的新策略。

实验方法优化

采用中性涂层羟丙基纤维素（HPC）毛细管，在20 kV分离电压和2.0 psi（13.8 kPa）外压条件下，获得最佳cyt c平台信号（RSD=1.8%）。通过调整进样压力（1.0 psi）和时间（90 s），实现了复合物与游离cyt c的高效分离。

结合特性解析

• Apt76：特异性结合占比达82%，λ值（6.90×10⁴ M^?1）显示其非特异性结合弱于Apt40（2.83×10⁴ M^?1）

• 结构优势：76-mer长链形成的多环结构增强结合特异性，与厚度剪切模式声学检测结果吻合

• 迁移率校正：通过引入μ_ep,ACn等参数，将原始数据K_a从1.65×10⁶ M^?1修正至6.76×10⁵ M^?1

技术对比验证

荧光滴定显示结合强度排序Apt76>61>40，与PACE-FA结果一致。其中Apt61的K_a（6.25×10⁵ M^?1）与文献报道的K_d（4.6 μM）换算值高度匹配。

应用前景

该技术突破了传统表面等离子共振（SPR）需固定化造成的结构变形局限，为SELEX筛选的高效验证提供了新工具。未来可拓展至肿瘤靶向治疗中凋亡通路调控研究。