泪液蛋白质组学揭示肌萎缩侧索硬化症新型生物标志物特征及其诊断价值研究

本研究针对肌萎缩侧索硬化症(ALS)诊断困难的问题，通过数据非依赖采集质谱技术(DIA-MS)分析49例ALS患者和54例对照者的泪液(TF)蛋白质组，鉴定出106个差异蛋白。研究发现SERPINC1和HP等6个蛋白组成的特征可有效区分ALS患者，经独立队列验证证实其诊断潜力。该研究为ALS提供了首个基于泪液的微创诊断方案，揭示了神经炎症在ALS发病中的关键作用。

　　

在神经退行性疾病领域，肌萎缩侧索硬化症(ALS)的诊断始终面临巨大挑战。这种累及上下运动神经元的致命性疾病，从症状出现到确诊平均需要10-16个月，严重延误了治疗时机。目前的诊断主要依赖临床表现和神经电生理检查，缺乏客观的生物学标志物。虽然脑脊液(CSF)中的神经丝蛋白(NfL)和几丁质酶(CHIT1)等标志物展现出一定潜力，但腰穿刺的有创性限制了其临床应用。血液标志物又因血脑屏障的阻隔难以准确反映中枢神经系统病变。这种诊断困境促使研究者将目光投向了一种意想不到的生物样本——泪液。

泪液作为"大脑的窗口"，具有独特的解剖学优势。它通过脑干神经反射弧与中枢神经系统相连，且含有血液超滤液成分。更关键的是，泪液采集完全无创，使用Schirmer试纸条即可轻松获取。此前研究已在帕金森病和阿尔茨海默病患者的泪液中检测到α-突触核蛋白和tau蛋白等标志物。那么，泪液是否也能为ALS提供诊断线索？来自德国慕尼黑工业大学的Lena-Sophie Scholl和Antonia F. Demleitner领衔的研究团队在《Acta Neuropathologica Communications》上发表的研究给出了肯定答案。

研究人员采用多组学技术路线，首先通过DIA-MS对49例ALS患者和54例健康对照的泪液进行全蛋白质组分析，随后在51例ALS和52例对照的独立队列中进行Western blot验证。关键技术包括：1)使用Schirmer试纸条标准化采集泪液样本；2)采用SP3方法进行高效蛋白提取和酶解；3)基于离子淌度分离的DIA-PASEF质谱技术实现高灵敏度蛋白质组检测；4)应用机器学习算法筛选生物标志物组合。

泪液蛋白质组特征揭示ALS特异性改变

研究团队在泪液中鉴定出876个稳定表达的蛋白质，其中106个在ALS患者中呈现显著差异。令人惊讶的是，89%的差异蛋白在ALS组表达下调，特别是免疫球蛋白家族成员。基因集富集分析(GSEA)显示，与"免疫系统"相关的17个通路中有16个显著下调，包括"免疫反应"(NES=-1.95)和"适应性免疫反应"(NES=-1.67)。蛋白互作网络分析进一步发现，HP、CLU、SERPINA3等蛋白构成的调控网络在ALS中明显受损，这些蛋白主要参与"防御反应"和"蛋白酶解调控"等生物学过程。

机器学习筛选六蛋白诊断特征

研究团队采用支持向量机(SVM)等四种机器学习算法，从876个蛋白质中筛选出最具诊断价值的组合。最优模型SVM线性核达到AUROC 0.77的判别性能。通过特征重要性分析，最终确定了一个六蛋白标志物组合：CRYM(μ-结晶蛋白)、PFKL(肝型磷酸果糖激酶)、CAPZA2(F-肌动蛋白加帽蛋白α2亚基)、ALDH16A1(醛脱氢酶家族16成员A1)、SERPINC1(抗凝血酶-III)和HP(结合珠蛋白)。这组蛋白在ALS患者泪液中均显著下调，联合使用时可达到66.2%的AUROC。

独立队列验证关键标志物

在验证队列中，研究人员通过Western blot证实了SERPINC1和HP的显著差异。ALS患者泪液中SERPINC1水平(-0.12 vs 0.08，p_adj=0.037)和HP水平(0.04 vs 0.54，p_adj=0.050)均显著低于对照组。Lasso回归模型分析显示，SERPINC1、HP和CRYM是区分ALS的最关键指标。值得注意的是，SERPINC1在血液和CSF中的变化模式与泪液一致，提示其可能作为跨生物流体的ALS标志物。

标志物蛋白的病理学意义

研究发现的核心标志物中，SERPINC1作为丝氨酸蛋白酶抑制剂，不仅调控凝血级联反应，还具有抗炎作用。既往研究报道ALS患者血清中SERPINC1水平降低，且与疾病快速进展相关。HP作为急性期蛋白，在氧化应激和神经炎症中起关键作用。虽然血清HP在ALS中升高，但CSF水平却降低，这种差异可能反映了血脑屏障功能紊乱。CRYM在皮质脊髓运动神经元发育中起重要作用，其表达缺失可能与ALS"逆行性死亡"病理过程相关。

这项研究开创性地证实了泪液作为ALS生物标志物来源的可行性。相比传统CSF检测，泪液采集完全无创，可重复性强，特别适合疾病动态监测和临床试验评估。研究发现的核心标志物SERPINC1和HP不仅具有诊断价值，其涉及的凝血和炎症通路更为理解ALS发病机制提供了新视角。虽然当前模型的判别性能还需提升，但这项研究为开发ALS微创诊断技术奠定了重要基础。未来扩大样本量和纳入前驱期患者，将有助于进一步提高标志物的敏感性和特异性，最终实现ALS的早期诊断和精准分型。