基于无催化剂生物正交策略的活体梅毒螺旋体原位高分辨率成像技术研究

本文创新性地开发了一种基于聚集诱导发光原（AIEgens）的无催化剂生物正交标记策略，首次实现了活体梅毒螺旋体（T. pallidum）的原位高分辨率成像。通过活化炔烃修饰的TPA-TA分子与病原体蛋白的点击化学反应，在保持螺旋体活性的同时，实现了低背景、高稳定性的实时动态追踪，为阐明梅毒免疫逃逸机制提供了重要工具。

　　

1 引言

梅毒是由苍白螺旋体（Treponema pallidum）引起的性传播疾病，全球年感染量达800万例。该病原体具有独特的免疫逃逸能力，但由于缺乏活体追踪技术，其致病机制研究长期受限。传统检测方法如暗视野显微镜（DFM）和银染色无法实现实时观测，电子显微镜虽能展示静态结构却无法反映动态过程。荧光成像技术虽具有高灵敏度，但传统荧光分子易发生聚集诱导淬灭（ACQ）。聚集诱导发光原（AIEgens）因其优异的光稳定性和高发光效率成为理想解决方案，但现有代谢标记策略依赖病原体代谢活性，而梅毒螺旋体体外培养技术尚不成熟。

2 结果与讨论

2.1 AIEgens的合成与表征

研究团队设计合成了含活化炔基的AIE分子TPA-TA，其分子结构中含有的C≡C键（红外吸收峰2100 cm^-1）能与蛋白质氨基发生点击反应。光谱分析显示TPA-TA在650 nm处具有典型发射峰，且在水相中表现出显著AIE效应。与商业探针PI和Cy5-Ab相比，TPA-TA在白光照射（500 mW/cm²）下展现出卓越的抗光漂白能力。

2.2 梅毒螺旋体标记可行性

CCK-8实验证实TPA-TA对Sf1Ep、HUVEC和THP-1细胞的存活率>90%。超分辨荧光显微镜（SRFM）显示TPA-TA能清晰标记螺旋体整体结构，每个病原体可稳定结合约3.2×10⁷个AIE分子。SDS-PAGE和FT-IR证实TPA-TA通过酰胺键（1641 cm^-1）共价结合螺旋体表面蛋白，且不影响其粘附功能。

2.3 不同状态病原体标记

首次将精子活力分级概念应用于梅毒螺旋体运动性评价：新鲜分离株呈现弯曲/旋转运动（1.44 μm/s），冻存复苏株为前向运动（0.74 μm/s），灭活株仅布朗运动（0.36 μm/s）。TPA-TA可标记所有状态病原体，而PI和抗体仅能标记死亡螺旋体。

2.4 病原体-细胞互作实时成像

SRFM动态观测显示：螺旋体通过粘多糖酶介导粘附Sf1Ep细胞；以内吞方式穿越HUVEC内皮屏障；THP-1巨噬细胞的吞噬效率在含二期梅毒血清（SSS）组显著提升（p<0.001），证实Fcγ受体介导的调理吞噬机制。Nanolive成像捕捉到2小时内完整的吞噬过程。

2.5 体内传播行为可视化

新西兰兔模型证实TPA-TA标记不影响病原体毒力：接种7天后出现典型皮疹，TRUST效价升高，组织病理显示大量淋巴细胞浸润（蓝色箭头）和浆细胞（黄色箭头）。活体成像显示标记信号可维持36小时，免疫荧光证实病原体在皮损中的动态分布。

3 结论

该研究建立的"一步法"标记策略突破了传统技术的代谢依赖性限制，首次实现活体梅毒螺旋体的高分辨率动态追踪。TPA-TA标记的病原体完整保留毒力和免疫原性，为阐明免疫清除与逃逸的分子机制提供了全新研究工具。未来可进一步开发具有深层组织穿透力的AIEgens，推动梅毒病理学研究进入实时可视化时代。