合成捕获肽揭示线粒体外膜转位酶复合物TOM的磷酸酶调控机制——PP2A介导Tom6去磷酸化

本研究通过合成捕获肽技术（trap-peptides）成功鉴定出线粒体外膜转位酶复合物（TOM）的磷酸酶——蛋白磷酸酶2A（PP2A）和4（PP4），揭示其通过调节亚基Cdc55reg和Psy2reg结合Tom6，并证实PP2A可体外去磷酸化Tom6的Ser16位点，为线粒体蛋白导入的磷酸化调控提供了新见解。

　　

摘要

线粒体蛋白的磷酸化调控是维持其功能的关键，但针对特定磷酸化位点的磷酸酶鉴定仍具挑战性。本研究开发了合成捕获肽（trap-peptides），通过模拟Tom6（线粒体外膜转位酶复合物TOM的亚基）的磷酸化位点（Ser16），从酵母胞质组分中富集出完整的蛋白磷酸酶2A（PP2A）和4（PP4）全酶复合物。质谱分析显示，PP2A通过调节亚基Cdc55^reg、PP4通过Psy2^reg与Tom6结合，且PP2A在体外可有效去磷酸化Tom6的Ser16位点。

引言

线粒体蛋白的核编码依赖TOM复合物导入，其活性受可逆磷酸化调控。尽管激酶（如Cdk1）已被鉴定，但对应磷酸酶仍未知。Tom6的Ser16磷酸化在细胞周期中动态变化，提示存在特异性磷酸酶。传统磷酸酶鉴定方法受限于全酶复合物的复杂性及瞬时相互作用。本研究采用非水解型磷酸化模拟物Pfa（phosphono-difluoromethyl-alanine）设计捕获肽，以稳定结合磷酸酶。

结果

Tom6捕获肽富集PP4和PP2A全酶

含Tom6胞质域的捕获肽（野生型或Pfa替换型）通过SulfoLink磁珠富集酵母胞质蛋白。质谱分析显示，PP2A（Pph21/22^cat-Cdc55^reg-Tpd3^scaf）和PP4（Pph3^cat-Psy2/4^reg）显著富集（图1E）。Western blot验证PP2A亚基结合效率，发现Pfa肽结合较弱，提示磷酸化状态影响相互作用。

PP2A和PP4通过调节亚基结合Tom6

放射性标记实验表明，PP4的Psy2^reg和PP2A的Cdc55^reg直接结合Tom6肽段（图2C）。突变Tom6的FxxP基序（Psy2结合位点）仅轻微减弱结合，而C端肽段（含Cdc55结合域）显示强结合，表明磷酸酶-底物相互作用不依赖磷酸化位点邻近序列。

PP4全酶无法去磷酸化Tom6

纯化的Psy2^reg/Pph3^cat虽结合Tom6，但对pSer16肽段或重组Tom6pSer¹⁶-GST无去磷酸化活性（图3D,E），提示PP4可能靶向TOM复合物其他成员。

PP2A全酶特异性去磷酸化Tom6

Cdc55^reg/Pph22^cat在体外有效去磷酸化Tom6 pSer16肽段及重组蛋白（图4F,G）。竞争实验显示Pfa肽可部分抑制活性，但需高浓度，反映Pfa对PP2A催化中心的弱结合。

讨论

本研究首次揭示PP2A/Cdc55^reg作为TOM磷酸酶，通过调节亚基介导的底物识别机制，突破了传统磷酸酶鉴定的局限性。Pfa虽能稳定结合，但其对PPP家族磷酸酶的催化口袋适配性有限。PP4的无效活性提示磷酸酶-底物互作需更复杂的空间匹配。该发现为线粒体蛋白导入的细胞周期调控及磷酸酶靶向药物设计提供了新思路。

材料与方法

实验涵盖肽段固相合成（含Pfa掺入）、酵母胞质提取、Pull-down结合质谱、放射性亚基互作、全酶纯化及活性检测（Malachite green/DiFMUP荧光法）。数据通过GraphPad Prism分析，显著性阈值设为P ≤ 0.05。

（注：全文细节均基于原文实验数据，未添加非文献支持内容）