奶牛血浆小细胞外囊泡(sEV)中microRNA-181b-2-3p作为亚生育力早期标志物的发现与机制研究

这篇研究揭示了奶牛血浆小细胞外囊泡(sEV)中miRNA-181b-2-3p与亚生育力的显著关联。通过高通量测序和qRT-PCR验证，发现低生育力(LF)奶牛sEV中miR-181b-2-3p表达量是高生育力(HF)组的2.665倍(p=0.0093)，其通过调控GnRH、Wnt等生殖相关通路影响繁殖性能。该研究为畜牧业生育力早期诊断提供了新型分子标记。

　　

ABSTRACT

妊娠率和活产率是衡量人类和动物生育力的关键指标。研究聚焦血浆小细胞外囊泡(sEV)中microRNA(miRNA)的表达模式与荷斯坦奶牛亚生育力的关联。通过小RNA测序在初产奶牛(n=10/组)中发现14个差异表达miRNA(FDR<0.05，-logFC>2)，其中miR-181b-2-3p在低生育力(LF)组sEV中的表达显著高于高生育力(HF)组(p=0.0093，相对表达比2.665)。结果表明循环sEV miRNA可能参与调控奶牛生育性状。

1 Introduction

哺乳动物生育力取决于胚胎与子宫内膜发育的同步性。炎症性疾病如子宫内膜炎会通过促炎细胞因子影响子宫微环境，而抗炎因子如IL-4、IL-10则促进胚胎植入。小细胞外囊泡(sEV)作为细胞间通讯载体，其miRNA cargo能反映细胞代谢状态。此前研究发现sEV miRNA可调节子宫内膜炎症反应，但血浆来源sEV miRNA与生育状态的关联研究有限。本研究利用新西兰建立的生育力差异奶牛模型，探索sEV miRNA作为亚生育力早期标志物的潜力。

2 Materials and Methods

2.1 Ethics Approval

实验获新西兰Ruakura动物伦理委员会(RAEC)和澳大利亚昆士兰科技大学(UAEC)批准。

2.2 Animal Management

选用荷斯坦奶牛，按生育力育种值(FBV)±5%分为HF和LF组。发现研究采用初产奶牛(n=20)，验证研究使用10月龄青年母牛(n=16)。

2.3 sEV分离与表征

通过超速离心(UC)和尺寸排阻色谱(SEC)分离sEV，Western blot检测标志蛋白(Flot-1/CD81/CD9)，NTA分析粒径(30-200nm)，TEM观察形态。

2.4 miRNA分析

TRIzol法提取sEV RNA，NGS测序后使用edgeR进行差异分析。qRT-PCR验证采用miRCURY LNA试剂盒，U6 snRNA作为内参，2^-ΔΔCT法计算相对表达。

3 Results

3.1 sEV表征

WB证实sEV标志物阳性(Flot-1/CD81/CD9)，BSA/GAPDH阴性。TEM显示典型杯状结构，NTA确认粒径符合sEV特征。

3.2 miRNA差异表达

NGS发现209个差异miRNA(-logFC>2)，其中97个在HF组高表达，112个在LF组高表达。14个miRNA通过FDR<0.05筛选，包括HF组高表达的miR-17-5p/miR-2335-5p和LF组高表达的let-7e-5p/miR-181b-2-3p。

3.3 miR-181b-2-3p验证

qRT-PCR显示LF组sEV中miR-181b-2-3p表达显著高于HF组(p=0.0093)，效应量Cohen's d=1.48。

3.4 通路分析

miR-181b-2-3p靶向58个基因，调控GnRH受体通路(17.39%)、Wnt通路(4.35%)等生殖相关通路，并通过GSKIP抑制影响分娩过程。

4 Discussion

4.1 miRNA与亚生育力

miR-181b-2-3p在LF组的过表达可能通过抑制GSKIP和CDH8破坏Wnt信号，影响卵泡发育和胚胎植入。其与炎症通路(如NF-κB)的关联提示免疫-生殖轴调控机制。

4.2 研究局限性

样本年龄差异可能影响miRNA表达模式，未来需扩大种群验证。FBV评估体系的国际差异也需纳入考量。

4.3 应用前景

本研究首次报道miR-2285dd-3p等miRNA在sEV中的特异性分布，为开发非侵入性生育诊断工具奠定基础。miR-181b-2-3p或可作为跨物种生育力标志物候选。

5 Conclusions

血浆sEV miRNA谱可区分奶牛生育力状态，miR-181b-2-3p作为潜在标志物为繁殖管理提供新思路。其多通路调控机制为理解亚生育力生物学机制开辟新视角。