综述 | 单细胞RNA转录组学研究指南

这篇综述系统介绍了单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术在非模式生物研究中的应用框架，涵盖样本制备（细胞/核悬液优化）、商业平台选择（如10x Genomics、BD Rhapsody）、数据分析流程（Seurat/Scanpy）及跨物种比较挑战。

　　

单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术是解析生物体内不同细胞类型转录组特征的强大工具。通过标记单个细胞或细胞核的mRNA分子，这种技术可实现对转录组的无偏分析。

近日，维也纳大学神经科学与发育生物学系的Alison G. Cole在《Frontiers in Zoology》杂志上发表综述文章，介绍了开展单细胞RNA转录组学研究的标准流程，并强调了项目设计时需要考虑的关键因素。

基本原理

单细胞转录组学分析包括三个基本步骤。第一步是样本制备，需将感兴趣的组织转化为高质量的单细胞或细胞核悬液。第二步为分离目标细胞或细胞核，构建测序文库并进行双端测序。第三步是数据分析，包括将测序读数映射到参考基因组，再开展下游生物信息学分析。

建立流程

开展单细胞测序项目前，有两个基本前提。一是需要带有功能注释的基因模型，以便解读测序数据，若缺乏完整基因组注释，至少需要构建转录组组装。二是需建立适合目标组织的细胞或细胞核悬液制备方案。

选择单细胞还是单细胞核，取决于数据用途。完整细胞捕获在多数应用中更理想，因为细胞质mRNA数量更多；而对于难以分离的细胞（如神经元），细胞核分离更具优势。不过，在多数情况下，单细胞与单细胞核数据具有可比性。

对于难以获得高纯度悬液的组织，荧光激活细胞分选（FACS）可去除碎片，但也可能引发细胞应激或丢失脆弱细胞类型。解离过程会引发细胞转录反应，冰上消化可缓解此问题，但会减慢消化速度。

仪器试剂

目前的细胞捕获和文库生成方案在细胞收集方式上存在差异，最低起始量要求也不同。例如，10× Genomics的液滴微流控方案可捕获500-20,000个细胞；Illumina的液滴捕获方案无需微流控平台，在大小上无限制。

微孔板分选方案（如BD Rhapsody）的细胞容量更大；基于平板的组合条形码方案（如Scale BioScience）可处理超过10万个细胞，因此成本更低。单次运行捕获的细胞越多，成本越低，因此小规模项目将产生更高的单细胞成本。

成本评估

单细胞测序实验的成本包括样本制备、文库制备和测序成本，计算资源和数据存储需求也随着数据集增大而增加。

在小规模项目中，文库制备和测序成本占主导，平台选择和细胞数量至关重要；大规模项目则以测序成本为主。通过优化细胞数量、样本混合或调整测序深度等策略，可平衡不同规模项目的成本与数据质量。

开展实验

细胞或细胞核悬液制备好后，需采用分离方法，包括自动化分选和微流控捕获。无论哪种方法，分离的样本都要进行条形码标记，主要通过逆转录反应实现。之后，在文库制备阶段进行大规模混样，然后开展双端测序，目前主要在Illumina平台上完成，其他测序平台也在发展中。

数据分析

测序数据需映射到合适的参考序列（基因组或转录组）。由于技术依赖mRNA的poly-A尾，捕获序列偏向基因3'端，因此基因模型的3'端注释需关注。对于新的模型系统，长读长转录组数据很有价值。

商业化平台提供测序比对和样本拆分流程，序列比对后按基因、样本和独特分子标识符（UMI）分类，UMI可用于消除PCR扩增重复，测序饱和度可通过UMI折叠程度估计，10× Genomics建议每个细胞至少测序20,000对读数，若测序饱和度低于80%，可能需要额外测序。

所有商用试剂盒都提供从测序数据生成计数矩阵的生物信息学流程，通常还提供标准聚类输出。下游数据分析主要基于R或Python平台，有完善的软件包和社区驱动的最佳实践手册。

目前的大多数流程会对通过过滤的细胞进行归一化，然后鉴定高度可变的基因用于降维，通常选取前2000个，异质性高的数据集可纳入更多基因。降维常用主成分分析，再基于选定维度构建邻域图，用于聚类或可视化（如tSNE/UMAP等）。

其他考虑

在收集多个样本时，常需合并为单个数据集，可通过降维图评估是否需要计算整合以消除批次效应。常用方法包括mutual nearest neighbors（MNN）校正、Seurat中的canonical correlation analysis（CCA）以及Harmony等，这些工具可综合样本数据并保留生物变异性。

单细胞RNA测序数据还可用于重建细胞特化路径等发育过程研究，通过计算工具来推断细胞沿发育路径的排序（拟时间），揭示谱系关系和分支点，但尚无单一方法表现最优，结合人工智能的方法也在兴起。

文章指出，新用户应根据实验目标来评估商业化平台，固定细胞的兼容性和与多组学的兼容性会影响方法选择。建议先进行试点实验，确认所有步骤正常后再进行大规模测序。

随着更多数据的积累，将有助于深入了解细胞分化路径、谱系关系和细胞类型进化。此外，测序技术的进步也将拓展研究视野，推动多个领域的发展。