应用G&T-seq技术从脐带血中分离具有完整基因组DNA的有核红细胞：推动无创产前检测新突破

这篇研究通过单细胞基因组与转录组测序（G&T-seq）技术，从脐带血中高效筛选出处于原始成熟阶段的有核红细胞（fNRBCs），其基因组DNA完整性显著优于成熟红细胞。该策略为基于胎儿细胞的非侵入性产前检测（NIPT）提供了新思路，可克服胎盘嵌合体干扰，提升胎儿染色体异常和单基因病的诊断精度。

　　

ABSTRACT

Purpose

胎儿细胞是获取胎儿基因组DNA的纯净来源，但分离难度大。研究评估了单细胞基因组与转录组测序（G&T-seq）能否高效分离适用于基因检测的胎儿有核红细胞（fNRBCs）。

Methods

以脐带血为模型，从4份样本中分离165个NRBC候选细胞，并设置12个淋巴细胞对照。通过转录组数据评估NRBC成熟阶段，并利用浅层全基因组测序（WGS）分析基因组完整性。

Results

转录组多维标度（MDS）分析显示，5个NRBC候选细胞被归类为原始阶段NRBCs，其中2个细胞的WGS文库产量和比对率与淋巴细胞相当，表明其基因组完整性良好。

Conclusions

G&T-seq能有效从成熟红细胞主导的样本中筛选出DNA质量高的原始NRBCs，为基于fNRBC的NIPT发展提供了技术支撑。

1 Introduction

无创产前检测（NIPT）目前主要依赖胎盘来源的游离DNA（cfDNA），但母源DNA占比高达80%~95%，且存在胎盘嵌合体风险。1959年发现的胎儿有核红细胞（fNRBCs）因携带纯胎儿基因组DNA，成为更理想的NIPT靶标。与其他胎儿细胞相比，fNRBCs在分娩后迅速消失，避免了既往妊娠干扰。

研究团队前期通过流式分选（FACS）结合表面标记（CD71/CD235a）分离fNRBCs，但全基因组扩增（WGA）效率不稳定，推测与细胞成熟度导致的DNA降解有关。本研究假设原始阶段NRBCs保留完整基因组DNA，并利用G&T-seq技术同步分析转录组和基因组特征。

2 Materials and Methods

2.1 样本采集

收集4份脐带血（2雌2雄）和1份成人外周血。

2.2 细胞分选与标记

通过FACS分选CD45^?/CD71⁺/CD235a⁺的NRBC候选细胞，淋巴细胞作为对照。

2.3 G&T-seq流程

改良版G&T-seq同步生成RNA-seq和WGA-WGS文库，使用SMARTer PicoPLEX Gold试剂盒扩增基因组DNA。

2.4 数据分析

转录组通过Salmon量化基因表达，WGS数据用DRAGEN比对GRCh38参考基因组，评估染色体读长分布一致性。

3 Results

3.1 淋巴细胞验证实验

单细胞RNA-seq检测到3962~6968个基因，WGA-WGS文库染色体分布与常规WGS高度一致（相关系数>0.99），证实技术可靠性。

3.2 NRBC候选细胞分析

165个NRBCs中，5个细胞（3%）表达原始阶段标志基因（GYPC/CD36/CD47），其转录组特征介于淋巴细胞与成熟NRBCs之间。其中2个细胞（1.2%）的WGS数据质量最优：文库产量达3720~3960 fmol，比对率90%~98%，染色体分布与对照WGS相关性达0.97。

4 Discussion

研究首次证实原始阶段fNRBCs的基因组DNA更适合WGA扩增。尽管脐带血中原始NRBCs仅占3%，但G&T-seq可精准筛选，避免成熟细胞干扰。未来结合核染色（如Hoechst33342）分选有望进一步提高富集效率。

局限性包括未明确细胞母源/胎源属性（需母体样本对照），且WGS深度不足难以检测单核苷酸变异。但该技术为开发高精度fNRBC-NIPT奠定了基础，尤其对单基因病和染色体微缺失综合征的诊断具有重要意义。

致谢与伦理声明

研究获日本国立儿童健康发育中心资助（2023B-8、2022A-3）及文部科学省科研费（JP23K15853）。所有实验经伦理委员会批准（IRB 699），受试者签署知情同意书。