Piezo-胞浆内单精子注射中极体旁位点注射技术提升牛胚胎早期发育效率的研究

这篇研究通过优化Piezo-ICSI（胞浆内单精子注射）技术，提出将精子注射位点调整至第一极体（PB）旁侧（2或4点钟方向），以利用卵周隙最宽区域减少卵膜损伤。实验证实该方法显著提高卵母细胞存活率（90.1% vs 75.0%），且不影响纺锤体完整性和囊胚染色体正常率（75.0% vs 72.7%），为动物和人类辅助生殖技术提供了改进方案。

　　

1 引言

胞浆内单精子注射（ICSI）技术已广泛应用于人类和牲畜生殖领域，但传统方法（c-ICSI）因穿刺卵膜时的机械损伤存在局限性。Piezo-ICSI通过压电脉冲辅助穿刺，显著提升受精率，但注射位点对卵膜和纺锤体的影响尚未明确。本研究创新性地提出将注射位点从传统的3点钟方向（对应极体6/12点钟位置）调整为极体旁侧（2/4点钟方向），利用卵周隙最宽区域减少压电脉冲对卵膜的损伤。

2 材料与方法

2.1 卵母细胞制备

牛卵巢取自屠宰场，通过穿刺法获取优质卵丘-卵母细胞复合体，经体外成熟培养22-25小时。

2.2 注射技术优化

实验分为三组：传统Piezo组（极体6/12点钟方向）和极体旁注射组（2/4点钟方向），对比分析压电脉冲强度（1或12）与卵膜距离（长/短/接触）对存活率的影响。通过碘化丙啶（PI）染色和Fluo-4 AM钙离子检测评估膜完整性，Oosight成像系统监测纺锤体动态。

2.3 胚胎评估

记录卵母细胞存活率、囊胚形成率（第7天），并通过醋酸-乙醇固定和吉姆萨染色分析囊胚染色体倍性（正常二倍体60, 2n）。

3 结果

3.1 压电脉冲的膜损伤效应

当压电脉冲贴近卵膜（距离≤0）时，卵母细胞存活率骤降至8.3%（强度12），Fluo-4 AM荧光强度升至100.9 AU，表明Ca²⁺内流加剧。

3.2 纺锤体安全性

极体旁注射组纺锤体异常率（11.4%）与传统组（7.5%）无显著差异，Oosight显示注射时纺锤体会被卵膜流体压力推开。

3.3 发育潜能

极体旁注射组卵母细胞存活率提升至90.1%，囊胚率（24.0%）和染色体正常率（75.0%）与传统组相当，证实该方法在保障胚胎质量的同时增加可用胚胎数量。

4 讨论

压电脉冲产生的微流效应可能导致卵膜轻微损伤，而极体旁位点注射通过扩大卵周隙操作空间，有效缓冲机械应力。尽管纺锤体与极体位置不完全关联，但卵膜的弹性位移可避免纺锤体直接损伤。该技术为临床ICSI提供了新策略，尤其适用于卵膜脆弱的病例。未来需进一步探索其在人类卵母细胞中的应用潜力。

（注：全文数据均基于5次独立实验的均值，统计方法采用ANOVA和卡方检验，p<0.05为显著差异）