重组牛β-防御素的抗菌与抗炎双重功能在脓毒症治疗中的探索性研究

本研究针对牛源脓毒症治疗中抗生素耐药性难题，创新性利用乳酸乳球菌表达系统制备五种重组牛β-防御素（BNBD1-4/TAP），系统评估其对大肠杆菌的抗菌活性、脂多糖（LPS）结合与中和能力，以及上皮细胞免疫调节功能。结果表明BNBD4展现强效抗菌特性（降低大肠杆菌载量≥3 log10 CFU/mL），而TAP在LPS中和（EC50 0.065μM）和免疫调节方面表现突出，为开发靶向病原体清除与炎症调控的双功能疗法提供新思路。

　　

脓毒症是威胁牛群健康的重要疾病，尤其对免疫系统未成熟的犊牛致死率极高。革兰阴性菌（如大肠杆菌）释放的脂多糖（LPS）会触发过度炎症反应，而现有抗生素因耐药性问题疗效受限。牛β-防御素作为天然免疫系统的多效肽，兼具直接抗菌和调节免疫的潜力，但其在脓毒症治疗中的应用价值尚未充分挖掘。来自西班牙IRTA研究所的Cristina Saubi团队在《Veterinary Research》发表的研究，首次系统评估了五种重组牛β-防御素的多功能特性，为开发新型抗脓毒症策略提供理论依据。

研究采用乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）表达系统生产融合绿色荧光蛋白（GFP）的β-防御素（BNBD1-4和TAP），通过亲和色谱纯化获得高纯度蛋白。关键实验技术包括：1）使用荧光探针BODIPY? cadaverine检测LPS结合能力；2）通过全血培养模型评估LPS诱导的TNFα中和效果；3）采用人结肠上皮细胞（Caco-2）分析IL-8分泌的免疫调节作用；4）标准化抗菌实验通过滴板法测定大肠杆菌BW25113的菌落形成单位（CFU）。

抗菌活性差异显著

研究团队发现五种β-防御素对抗大肠杆菌的效果存在明显分化。如图1所示，仅rBNBD4和rTAP在1μM浓度下表现出显著抗菌活性，其中rBNBD4可使细菌载量降低≥3 log₁₀ CFU/mL。这种差异可能与BNBD4独特的带正电荷精氨酸分布有关——其序列中存在两个连续精氨酸（R）和两个邻近的N/C端精氨酸簇（图5），这种结构可能增强其与细菌膜的相互作用。

LPS结合与中和能力解耦

通过荧光位移实验测定（图2），所有β-防御素均能有效结合LPS，其中rTAP的EC₅₀最低（0.065μM）。但全血实验揭示（图3），LPS结合能力与炎症调控并非简单线性关系：rBNBD3虽结合力中等（EC₅₀ 0.295μM），却能显著抑制LPS诱导的TNFα分泌；而结合力最强的rBNBD1（EC₅₀ 0.092μM）却无此效果。更值得注意的是，rBNBD2和rBNBD4反而会增强炎症反应，提示其可能通过TLR4下游信号通路发挥免疫调节作用。

上皮免疫的安全调控

在Caco-2细胞模型中（图4），所有β-防御素在1μM浓度下均未表现细胞毒性，且仅诱导适度的IL-8分泌（<200 pg/mL）。这种可控的免疫激活特性具有重要意义——既能增强黏膜屏障防御，又避免过度炎症导致的组织损伤。

这项研究首次系统比较了牛源β-防御素的多功能谱，揭示其功能多样性：rBNBD4侧重直接杀菌，而rTAP擅长LPS中和与免疫调节。这种特性分化提示组合疗法可能更具优势——例如rBNBD4清除病原体，rTAP控制炎症风暴。研究采用的乳酸乳球菌表达系统克服了化学合成法的成本瓶颈，为规模化生产奠定基础。尽管仍需验证体内药效（如犊牛脓毒症模型），但该成果为开发替代抗生素的新策略提供了重要理论支撑，尤其对解决犊牛高死亡率这一畜牧业难题具有潜在转化价值。