天麻多糖分级乙醇沉淀法提取的葡聚糖通过caspase介导的凋亡途径抑制多种癌细胞增殖的机制研究

本研究针对天麻(Gastrodiae Rhizoma)多糖抗肿瘤机制不明的问题，通过分级乙醇沉淀法提取三种中性多糖GRP40-F0、GRP75-F0和GRP90-F0，综合运用HPGPC、GC-MS、NMR等技术解析结构特征，发现GRP90-F0通过激活caspase-9/AKT/p-PI3K通路诱导Hela等7种癌细胞凋亡，为开发新型植物源抗肿瘤药物提供理论依据。

　　

在肿瘤治疗领域，传统化疗药物普遍存在靶向性差、毒副作用大等问题，而天然多糖因其低毒性和多重生物活性成为研究热点。天麻作为传统中药材，其多糖成分虽已被证实具有免疫调节、神经保护等功效，但关于其抗肿瘤活性的结构基础和作用机制仍存在三大关键问题：多糖的精细结构特征不明确、影响抗肿瘤效果的关键因素未阐明、相关分子通路缺乏系统研究。这些知识空白严重限制了天麻多糖的临床应用开发。

为破解这些难题，Maryam Akhtar等研究团队在《Journal of Agriculture and Food Research》发表最新成果。研究人员采用分级乙醇沉淀结合离子交换色谱技术，从天麻中分离纯化出GRP40-F₀、GRP75-F₀和GRP90-F₀三种多糖组分，通过高分辨质谱、核磁共振等先进表征手段解析其结构，并系统评估了其对Hela、MDA-MB-231等7种癌细胞的抑制作用及机制。

关键技术方法包括：1）采用40%/75%/90%梯度乙醇沉淀分级提取多糖；2）通过DEAE-52 FF柱和Sephacryl S-400 HR柱进行纯化；3）运用HPGPC测定分子量分布；4）结合GC-MS和NMR（¹H、¹³C、2D）解析糖苷键构型；5）采用CCK-8法检测细胞活力；6）借助流式细胞术分析凋亡率及线粒体膜电位变化；7）Western blot检测caspase-9等凋亡相关蛋白表达。

【结构表征结果】

通过甲基化分析和NMR鉴定，发现GRP90-F₀主要包含→4)-Glcp-(1→、→3,6)-α-Glcp-(1→和α-Glcp-(1→三种糖苷键，分子量为1.043×10⁶ Da。FT-IR显示其在3408 cm^-1处有典型O-H伸缩振动峰， Congo red实验证实其存在三螺旋结构。SEM显示其表面光滑规整，与GRP40-F₀的纤维状结构形成鲜明对比。

【抗肿瘤活性】

细胞实验显示GRP90-F₀对Hela细胞的IC₅₀为89.17 μg/mL，显著优于其他组分。Hoechst 33342染色观察到典型凋亡形态：核固缩、染色体凝聚。Annexin V-FITC/PI双染证实500 μg/mL处理48小时可使晚期凋亡细胞比例升至16.2%。值得注意的是，该多糖对正常肝细胞L-02的毒性较低（IC₅₀=178.6 μg/mL），显示良好选择性。

【机制研究】

Western blot揭示GRP90-F₀通过线粒体途径诱导凋亡：1）激活caspase-9和caspase-3；2）降低ΔΨm（膜电位检测下降34.9%）；3）促进ROS生成（增加31.06%）。ELISA检测显示其可剂量依赖性增加p-PI3K水平，表明PI3K/AKT通路参与调控过程。

这项研究首次系统阐明天麻多糖GRP90-F₀的抗肿瘤构效关系，证实其核心活性源于→4)-α-吡喃糖苷键主导的三螺旋结构。相比传统化疗药物，该多糖具有多靶点、低毒性的独特优势，为开发新型植物源抗肿瘤制剂提供了重要理论支撑。未来研究可进一步优化提取工艺，并开展体内药效评价，推动其向临床应用转化。