DCLK3通过自磷酸化稳定C端尾段并调控Tau蛋白磷酸化的分子机制研究

研究人员针对"暗激酶组"中未被充分研究的双皮质素样激酶3(DCLK3)，通过计算模拟与实验验证相结合，揭示了其独特的自磷酸化调控机制：不同于同源蛋白DCLK1的ATP结合口袋自抑制，DCLK3通过C端尾段磷酸化稳定在底物结合槽的新构象。研究首次鉴定Tau蛋白为DCLK3体外底物，发现其通过KXGS基序磷酸化影响微管结合，并阐明DCLK3通过泛素-蛋白酶体途径调控蛋白稳定性的分子机制，为神经退行性疾病治疗提供新靶点。

　　

在人类庞大的激酶组中，约三分之一成员仍属于功能未知的"暗激酶"，双皮质素样激酶3(Doublecortin-like kinase 3, DCLK3)就是其中典型的谜题。作为DCLK家族最神秘的成员，DCLK3虽被发现与亨廷顿病小鼠的神经保护作用相关，但其分子机制始终笼罩在迷雾中。更令人困惑的是，相较于被广泛研究的"兄弟"DCLK1和DCLK2，DCLK3在各类细胞和组织中表达量极低，这种"低调作风"使其长期逃避科研人员的追踪。随着对神经退行性疾病机制的深入探索，科学家们逐渐意识到：揭示DCLK3的神秘面纱，可能为阿尔茨海默病等tau蛋白病变开辟新的治疗途径。

这项发表在《Journal of Biological Chemistry》的研究采用了多学科交叉的研究策略。研究人员首先通过AlphaFold 3进行蛋白质结构预测，结合分子动力学模拟分析构象变化；运用ADP-Glo生物发光法检测激酶活性；通过质谱技术鉴定自磷酸化和泛素化位点；利用Phosformer-ST深度学习模型预测底物特异性；并采用免疫共沉淀验证蛋白相互作用。细胞实验使用HEK293T细胞系，通过MG132处理和环己酰亚胺追踪实验研究蛋白稳定性。

结构差异与细胞表达特征

通过比较DCLK家族三个成员的结构特征，发现DCLK3的C端尾段仅有35个氨基酸，远短于DCLK1(93aa)和DCLK2(115aa)。单细胞RNA测序数据显示，DCLK3在各类神经元中的转录水平显著低于其同源蛋白，这解释了为何其长期难以被检测。AlphaFold 3建模显示，DCLK3的C端尾段虽不能像DCLK1那样阻断ATP结合口袋，但能部分占据底物结合的C叶区域。

DCLK3自磷酸化的生化特征

研究人员成功在大肠杆菌中表达并纯化了DCLK3激酶结构域(356-648aa)，这是首次实现DCLK3重组蛋白的制备。差示扫描荧光法证实野生型DCLK3能与Mg²⁺-ATP结合，而激酶死亡突变体(D499A)则丧失该能力。ADP-Glo检测和Western blot均证实DCLK3具有自磷酸化活性，这种修饰导致蛋白电泳迁移率改变。

自磷酸化稳定C端尾段的机制

质谱分析鉴定出T358、T619、S31、S632和S638五个自磷酸化位点，其中S632和S638位于C端尾段。分子动力学模拟揭示，磷酸化的C端尾段通过pS632/pS638与激酶结构域中的R554/R558形成氢键网络，将尾段锚定在底物结合槽。这种独特的结合模式不同于DCLK1的ATP口袋阻断机制，而是通过占据底物结合区域实现调控。

Tau蛋白作为DCLK3底物的验证

利用Phosformer-ST模型预测，发现微管相关蛋白Tau可能是DCLK3的高置信度底物。体外激酶实验证实，DCLK3能磷酸化Tau蛋白的S262、S324和S356位点，这些位点均位于调控微管结合的KXGS基序内。免疫共沉淀实验显示，DCLK3更倾向于与磷酸化形式的Tau蛋白相互作用。

泛素-蛋白酶体途径调控DCLK3稳定性

MG132处理实验表明，抑制蛋白酶体可导致DCLK3剂量依赖性积累。环己酰亚胺追踪实验测得DCLK3半衰期约15.5小时。质谱鉴定出K244、K333、K395、K479、K496和K599六个泛素化位点，其中靠近HRD和DFG催化基序的K496修饰程度最高。这些发现解释了DCLK3低表达量的分子基础。

这项研究首次系统揭示了DCLK3的多层次调控网络：自磷酸化诱导的C端尾段构象变化提供了一种全新的激酶调控范式；Tau蛋白作为生理底物的鉴定将DCLK3与神经退行性疾病直接关联；而泛素化介导的快速降解则解释了其"隐形"特性。特别值得注意的是，DCLK3在Tau蛋白KXGS基序上的磷酸化，这些位点恰是阿尔茨海默病中异常修饰的热点区域，这为理解tau蛋白病变的分子机制提供了新视角。研究展示的计算与实验相结合的"暗激酶"研究范式，也为探索其他未被表征的蛋白激酶提供了可借鉴的路线图。