FBXO9通过GSK-3β依赖性机制介导YAP泛素化降解：揭示膀胱癌治疗新靶点

本研究针对Hippo/YAP信号通路调控机制不清的问题，揭示了SCF-FBXO9-CRL1复合物通过GSK-3β依赖性磷酸化识别YAP的CPD基序（Ser338/Thr342），促进其K76位点K48连接的多聚泛素化降解。该发现为联合PI3K抑制剂与化疗药物治疗YAP驱动型恶性肿瘤提供了新策略。

　　

Hippo信号通路的核心效应分子YAP（Yes-associated protein）作为转录共激活因子，在肿瘤发生发展中扮演着双重角色。尽管其作为治疗靶点的潜力巨大，但针对Hippo/YAP轴的药物开发仍面临挑战，亟需深入探索YAP的调控机制。现有研究表明，YAP可通过SUMO化、磷酸化和泛素化等多种翻译后修饰进行调控，但关于SCF（SKP1-Cullin1-F-box）E3泛素连接酶复合物对YAP的调控机制尚不明确。

在这项发表于《Journal of Biological Chemistry》的研究中，Yili Jin团队发现SCF-FBXO9-CRL1是调控YAP稳定性的新型E3泛素连接酶。研究人员通过CRL广谱抑制剂MLN4924处理膀胱癌细胞（HT-1197、T-24、5637），发现YAP蛋白水平显著升高而mRNA水平不变，提示CRL可能参与YAP降解。随后的Cullin家族筛选实验显示，Cul1的显性负性突变体（DN-Cul1）能特异性稳定YAP蛋白。

研究采用的主要技术方法包括：免疫共沉淀（Co-IP）验证蛋白互作、环己酰亚胺（CHX）追踪测定蛋白半衰期、体外激酶实验分析GSK-3β磷酸化活性、免疫荧光共定位观察亚细胞分布。临床相关性分析使用患者来源的FBXO9^fl/fl MEFs（小鼠胚胎成纤维细胞）和膀胱癌细胞模型。

2.1 YAP是SCF/CRL1-FBXO9的潜在底物

通过F-box蛋白筛选发现FBXO9和FBXW7均可结合YAP，竞争性实验表明二者存在互斥作用。结构域定位显示FBXO9的C端（aa 240-447）是其与YAP相互作用的关键区域。

2.2 FBXO9负调控YAP表达

在FBXO9基因敲除的HEK293细胞中，YAP蛋白水平显著升高；回补野生型FBXO9可逆转此现象。这一调控在结肠癌HCT116细胞和原代MEFs中均得到验证。

2.3 FBXO9缩短YAP蛋白半衰期并促进其多聚泛素化

泛素化分析显示FBXO9主要介导YAP的K48连接泛素化，沉默FBXO9使YAP半衰期从2.1小时延长至5.3小时。

2.4 FBXO9通过YAP磷酸化降解基序（CPD）与其互作

TA结构域的CPD基序（³³⁸SQLPT³⁴²）是FBXO9识别关键，S338A/T342A突变体丧失结合能力。K76R突变使YAP抵抗FBXO9介导的降解。

2.5 GSK-3β激活是YAP泛素化降解的必要条件

抑制剂TDZD-8处理显著减弱FBXO9-YAP相互作用。GSK-3β通过磷酸化CPD基序"启动"YAP，使其被FBXO9识别。体外激酶实验证实GSK-3β可直接磷酸化YAP。

2.7 应激条件促进YAP降解

低葡萄糖联合二甲双胍处理或短期缺氧（1% O₂）通过激活GSK-3β增强FBXO9对YAP的泛素化。

2.8 Akt信号抑制通过FBXO9靶向YAP增敏化疗

PI3K抑制剂（perifosine、AZD2014）通过解除Akt对GSK-3β的抑制，促进YAP降解。联合吉西他滨处理可显著增加PARP切割，表明该策略能克服膀胱癌化疗耐药。

这项研究首次阐明FBXO9作为E3连接酶调控YAP稳定性的分子机制，揭示GSK-3β介导的磷酸化是FBXO9识别YAP的前提条件。临床意义在于：①发现Akt/GSK-3β/FBXO9/YAP调控轴可作为治疗靶点；②提出PI3K抑制剂联合化疗的新策略；③为YAP在不同肿瘤中的差异性表达提供机制解释。研究局限性包括缺乏体内实验验证，以及未分析临床样本中FBXO9-YAP表达相关性。这些发现为开发针对YAP驱动型肿瘤的联合疗法奠定了理论基础。