基于有机修饰剂增强的AAV衣壳分析型阴离子交换整体柱分离技术研究

推荐：为解决腺相关病毒(AAV)空衣壳(E)与完整衣壳(F)在纯化样品中难以基线分离的难题，研究人员通过优化阴离子交换(AEX)色谱条件，系统评估了有机溶剂、Mg2+反离子和pH值对分离效果的影响。研究采用CIMac QA HR整体柱，开发出含2.5%乙腈和5 mM Mg(OAc)2的改进方法，实现了AAV2/8/9等多种血清型的E-F基线分离(R≥2.42)，并鉴定出部分填充衣壳(P)等亚群。该方法为基因治疗产品的快速质控提供了高效分析工具。

　　

基因治疗领域面临的关键挑战之一是如何精确分离腺相关病毒(AAV)载体中的空衣壳(empty capsids, E)与完整衣壳(full capsids, F)。当前主流的阴离子交换色谱(AEX)技术虽被广泛应用，但在复杂样品中往往难以实现E-F的基线分离，且存在血清型依赖性等问题。这些问题直接影响基因治疗产品的安全性和有效性评估，亟需开发更高效的分离分析方法。

为突破这一技术瓶颈，来自Sartorius BIA Separations的Timotej ?vanut、Sebastijan Peljhan等研究团队在《Analytica Chimica Acta》发表了创新性研究成果。研究人员系统考察了有机溶剂修饰剂对AAV8衣壳分离的影响，发现乙腈(ACN)在2.5%浓度时可使分辨率(R)从1.89提升至2.48。通过结合镁离子(Mg²⁺)与乙酸盐的反离子优化，在pH 8.5条件下建立了改进的AEX方法。该方法采用CIMac QA HR整体柱，利用线性梯度洗脱，不仅能实现E-F基线分离，还可识别部分填充衣壳(partially filled capsids, P)和过度填充衣壳等亚群。

关键技术方法包括：1) 采用PATfix生物色谱系统配合多波长UV、荧光(FL)和多角度光散射(MALS)检测；2) 数字PCR(dPCR)和ELISA定量分析；3) 质量光度法(MP)测定衣壳亚群；4) 密度梯度超速离心(DGUC)验证分离效果；5) 电荷检测质谱(CDMS)表征衣壳质量分布。

3.1 有机溶剂筛选

测试12种有机溶剂发现，乙腈在2.5%浓度时效果最佳，使E-F分辨率提升31%。溶剂通过改变蛋白质溶剂化层和镁离子络合能力影响分离，高浓度(>10%)会导致衣壳变性。

3.2 Mg²⁺和Ca²⁺盐筛选

比较镁/钙的氯化物、甲酸盐和乙酸盐发现，5 mM Mg(OAc)₂能产生最佳分离效果，乙酸盐的"亲液性"特性有助于提升分辨率。

3.3 pH优化

pH 8.5时获得最大分辨率(2.42)，过高(pH>9)或过低(pH<8)均会降低分离效率，这与衣壳表面电荷和稳定性平衡相关。

3.4 E-F分离验证

小规模制备实验结合正交分析证实，改进方法可获得96%-100%纯度的E衣壳(EL1)和82%-94%纯度的F衣壳(EL2)。CDMS和DGUC还检测到4%-49%的P衣壳亚群。

3.5 多血清型应用

该方法成功分离AAV2/8、AAV5、AAV8和AAV9的E-F组分，其中AAV9空衣壳不结合柱料，体现方法对不同血清型的适应性。

3.6 粗样品分析

在含大量杂质的AAV8裂解液中，光散射检测(LS)能特异性识别衣壳，证明方法适用于过程监控。

这项研究通过多参数优化建立的改进AEX方法，解决了基因治疗产品质控中的关键技术瓶颈。其创新性体现在：1) 首次系统阐明有机溶剂在AAV衣壳分离中的作用机制；2) 开发出通用性更强的线性梯度方法，相比阶梯梯度更具鲁棒性；3) 实现多种血清型E-F基线分离的同时，还能鉴定P衣壳等关键质量属性。该方法将显著提升基因治疗产品的开发效率和安全性评估水平，为行业建立新的分析标准。研究揭示的衣壳-溶剂-离子相互作用机制，也为其他病毒载体的分离纯化提供了重要参考。