PEG化高分子量松弛与紧张四聚体聚合人血红蛋白的生物物理与生化特性研究及其在血液替代品中的应用

为解决血红蛋白氧载体(HBOC)的安全性和有效性难题，研究人员对PEG化人血红蛋白(hHb)及紧张态(T)和松弛态(R)聚合人血红蛋白(PolyhHb)进行了系统表征。研究发现PEG化虽略微增加自氧化速率，但能维持热稳定性并显著降低触珠蛋白结合率，其中PEG-T-state PolyhHb展现出低氧亲和力(P50 46.6 mmHg)和快速氧释放特性，为新一代HBOC开发提供了关键理论依据。

　　

输血医学面临血液短缺、储存期短和突发灾害需求等全球性挑战，血红蛋白氧载体(HBOC)作为红细胞替代品备受关注。然而早期HBOC因血管收缩和氧化损伤等副作用未能通过临床试验，其核心矛盾在于细胞游离血红蛋白(Hb)的分子不稳定性和血管外渗问题。Mohd Asim Khan团队在《Bioconjugate Chemistry》发表的研究，通过创新性化学修饰策略——将聚乙二醇(PEG)与高分子量(500 kDa-0.2 μm)聚合人血红蛋白结合，系统评估了三种PEG化衍生物：PEG-hHb、PEG-T-state PolyhHb和PEG-R-state PolyhHb的生物物理特性，为开发安全有效的血液替代品提供了重要数据支撑。

研究采用动态光散射(DLS)测定流体力学直径，尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)估算分子量，停流光谱分析氧解离和触珠蛋白(Hp)结合动力学，圆二色谱(CD)检测二级结构变化，紫外可见光谱监测自氧化和血红素释放。实验样本来源于过期人红细胞纯化的血红蛋白。

3.1 PEG化血红蛋白的定量分析

通过氰化高铁血红蛋白测定发现，PEG-R-state PolyhHb的甲血红蛋白(metHb)水平最高(4.7±3.4%)，显著高于天然hHb，表明R态聚合与PEG化协同增加了氧化敏感性。

3.2 氧平衡曲线与玻尔效应

PEG-T-state PolyhHb保持低氧亲和力(P₅₀ 46.6 mmHg)，而PEG-R-state PolyhHb呈现超高亲和力(P₅₀ 1.9 mmHg)。PEG化使hHb的玻尔效应降低54%，T态聚合体降低73%，证实化学修饰会削弱pH依赖的氧释放调节能力。

3.3 触珠蛋白结合动力学

PEG-hHb与Hp的结合速率(0.072 μM^-1s^-1)显著低于天然hHb，而PEG化聚合体的结合速率进一步降至0.002 μM^-1s^-1，提示双重修饰可有效延缓巨噬细胞对HBOC的清除。

3.4 氧卸载动力学

PEG-T-state PolyhHb展现最快氧解离速率(44.4 s^-1)，符合其作为组织氧供体的功能定位，且PEG化未改变聚合体的本征氧释放特性。

3.7 聚合物尺寸与分子量

DLS显示PEG-R-state PolyhHb流体力学直径达31.5±7.4 nm，SEC-HPLC估算其分子量为1069 kDa，证实成功构建了超大分子复合体。SDS-PAGE显示PEG化使血红蛋白条带出现5 kDa间隔的特征性梯带。

3.9 过氧化氢氧化与高铁血红蛋白衰减

在1:10 H₂O₂应激下，PEG-hHb的硫血红蛋白(sulfHb)生成量最低(1.4 μM)，而PEG-T-state PolyhHb达5.2 μM，表明T态聚合体更易发生氧化损伤。

3.10 血红素释放实验

PEG-hHb的快速相血红素释放速率(15.4 h^-1)是天然hHb的8倍，但聚合使该速率降至0.75 h^-1，证明聚合交联是稳定血红素微环境的关键因素。

3.11 自氧化动力学

PEG化使hHb自氧化速率常数从0.010 h^-1增至0.024 h^-1，而PEG-T-state PolyhHb达0.026 h^-1，揭示PEG链通过增强水分子渗透促进氧化。

这项研究首次阐明PEG化与四聚体聚合对血红蛋白功能的协同调控机制：PEG化主要影响表面相互作用（如降低Hp结合），而聚合决定内部结构特性（如氧亲和力）。特别值得注意的是，PEG-T-state PolyhHb兼具低氧亲和性(P₅₀ 46.6 mmHg)和缓慢清除特性，这种"释放快、存留久"的组合使其成为创伤救治的理想氧载体。研究还发现R态聚合体虽然氧亲和力过高，但热稳定性最佳(77°C)，为特殊场景应用提供了备选方案。该工作通过多尺度表征揭示了化学修饰血红蛋白的结构-功能关系，为突破HBOC临床转化瓶颈提供了理论依据和实践指导。