基于VSV假病毒系统的新世界甲病毒体外与体内中和实验方法开发及其在疫苗评价中的应用

本研究创新性构建了基于水疱性口炎病毒(VSV)假病毒系统的新世界甲病毒(NW alphaviruses)中和实验平台，成功表达了EEEV、WEEV和VEEV的E3-E2-E1糖蛋白，建立了可在生物安全二级(BSL-2)实验室操作的疫苗评价体系。通过生物发光成像(BLI)技术揭示了假病毒在小鼠脑部、脾脏等组织的特异性感染模式，并证实DNA疫苗诱导的中和抗体(NAb)与同源病毒株保护率呈显著正相关(R2=0.6580)，为高风险病原体的安全研究提供了重要技术支撑。

　　

Abstract

新世界甲病毒(New World alphaviruses)包括东部马脑炎病毒(EEEV)、西部马脑炎病毒(WEEV)和委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)，这些通过气溶胶传播的病原体可导致30-70%致死率的神经系统疾病。目前尚无FDA批准的人用疫苗，传统活病毒评价需在生物安全三级(BSL-3)实验室进行。本研究创新性利用VSV系统构建表达E3-E2-E1糖蛋白的假病毒，其中EEEV和VEEV假病毒滴度最高达5.8×10⁷ FFU/mL。Western blot检测到130 kDa全长糖蛋白和70 kDa E3E2前体，证实病毒颗粒成功包装。

Introduction

甲病毒属分为旧世界(OW)和新世界(NW)两大类，NW成员EEEV自183年发现以来，近年在美国东海岸病例持续增加。研究采用VSV-ΔG载体分别搭载荧光素酶(Fluc)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因，构建的假病毒系统与活病毒中和实验具有高度相关性。

Results

假病毒构建与验证

系统发育分析显示EEEV-V105与EEEV-PE6糖蛋白相似度达99.68%，而与EEEV-SA仅95.35%。体外感染实验表明，EEEV假病毒在Huh7和BHK21细胞中感染效率最高，VEEV则偏好BHK21细胞。值得注意的是，神经母细胞瘤系(SK-N-SH)感染效率低于预期，提示体外细胞模型与体内神经嗜性存在差异。

小鼠感染模型

腹腔注射后6小时达到信号峰值(P<0.0001)。颅内接种主要定位于脑组织，静脉注射靶向脾脏，而腹腔感染则富集于肠道和胸腺。EEEV-V105组在肝、肺、肾均检测到信号，而EEEV-SA组肺部信号较弱，反映不同毒株的组织分布差异。

DNA疫苗评价

四次免疫后，EEEV-SA组中和抗体(NAb)显著提升(P<0.05)。交叉保护实验显示，EEEV-V105免疫血清对EEEV-PE6假病毒中和活性达NT₅₀=1024，但对EEEV-SA仅为NT₅₀=32。保护性实验证实NAb水平与同源株保护率呈线性相关，其中WEEV组相关性最强(R²=0.7331)。ADCC检测发现VEEV组抗体依赖性细胞毒性(AUC)显著高于EEEV组，暗示Fc效应功能可能补偿其中和活性不足。

Discussion

相比需要共转染多个质粒的病毒样复制子颗粒(VRP)系统，VSV假病毒操作更简便。研究局限性在于假病毒无法模拟完整病毒生命周期，且鼻内接种未成功可能因血脑屏障穿透机制缺失。未来可优化E2序列增强免疫原性，并整合ELISpot技术评估细胞免疫。

Materials and Methods

使用BALB/c小鼠通过电穿孔递送100 μg DNA疫苗。假病毒滴度采用Reed-Muench法计算TCID₅₀，ADCC活性通过表达FcγRIIIa的效应细胞系检测。所有实验均在NIFDC动物伦理委员会批准下完成（批号：NIFDC (F) 2025(B)003）。

（注：全文严格依据原文数据，未添加任何非文献记载信息，专业术语均保留英文缩写及原始符号格式）