基于三质粒CRISPR-Cas9平台的Bacillus velezensis 916高效生物防治剂工程改造

本研究成功构建了针对Bacillus velezensis（Bv）916的三质粒CRISPR-Cas9基因编辑平台，通过优化Cas9表达（P43启动子）、sgRNA设计（Psrf启动子）和同源重组片段，实现了单基因（96%）和双基因（61%）高效编辑。该平台应用于4种非核糖体肽合成酶（NRPS）基因簇启动子替换（PA/PB/P43/PrepU），衍生菌株BvLSBF的环脂肽（CLPs）产量提升5.9-10.9倍，显著增强对水稻纹枯病和瓜类角斑病的防治效果（抑菌活性提升90%），为农业可持续发展提供了安全高效的生物防治策略。

　　

研究背景

Bacillus velezensis（Bv）因其基因组富含非核糖体肽合成酶（NRPS）基因簇，能合成 surfactin、bacillomycin L、fengycin 和 locillomycin 等环脂肽（CLPs），成为植物病害生物防治的重要菌种。野生型Bv916经多年驯化可共生产4种CLPs，但其天然启动子调控限制了代谢物产量。传统CRISPR-Cas9系统在Bacillus subtilis中应用成熟，但针对Bv的编辑工具仍稀缺，亟需开发高效、安全的基因编辑平台。

平台构建与优化

研究团队设计了三质粒系统：

1. 1.

   pTN-Cas9：含优化BvCas9基因（Psrf启动子）和温度敏感复制子pET194ts；

2. 2.

   pTK/pTC：分别携带sgRNA（P43启动子）和同源重组模板（如CotB-GFP融合基因）。

通过替换ComX（P43启动子）和RecA（PrepU启动子）的天然启动子，显著提升转化效率（4倍）和重组效率（90%）。单轮编辑仅需5个工作日，双基因同步编辑效率达61%，远超传统单/双质粒系统（编辑效率35-55%）。

代谢工程应用

利用该平台对4个NRPS基因簇进行启动子替换：

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  Bv-srf-loc：surfactin（PA启动子）和locillomycin（PB启动子）产量分别提升5.9倍和2.6倍；

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  Bv-bl-fen：bacillomycin L（P43启动子）和fengycin（PrepU启动子）产量提升10.9倍和5.9倍；

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  BvLSBF：四基因协同表达使CLPs总产量最高提升10.9倍（HPLC-MS验证）。

生物活性与安全性

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  抑菌谱扩展：BvLSBF对Staphylococcus aureus的抑菌圈扩大至17 mm（对照±1-7 mm），对Fusarium oxysporum的抑制效率达+++级；

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  田间防效：对水稻纹枯病（90%）和瓜类角斑病（91%）的防治效果显著优于野生型（50%和43%）；

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  安全评估：衍生菌株保留抗生素敏感性（如氯霉素30 μg/disc敏感），无外源基因残留。

技术优势与展望

该平台突破传统Bacillus编辑瓶颈，其模块化设计支持多基因迭代编辑。未来可通过基因组整合Cas9和线性化模板进一步优化。研究为微生物农药开发、农业绿色防控及合成生物学提供了关键技术支撑，衍生菌株BvLSBF已具备产业化应用潜力。

（注：全文数据均源自原文实验，包括Western blot验证的151 kDa Cas9蛋白表达、共聚焦显微镜观察的孢子表面GFP/RFP标记等。）