基于生成式大语言模型的加密抗菌肽发现：PL-15对抗临床超级细菌的机制与应用

本文创新性地结合生成式大语言模型（LLM）与序列比对技术，从微生物蛋白组中挖掘出5种新型加密抗菌肽（c_AMPs），其中PL-15对碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）展现广谱杀菌活性（MIC低至2-4 μg mL?1），其通过破坏细菌膜结构、诱导活性氧（ROS）积累及清除生物膜的多重机制，为应对抗生素耐药危机提供新策略。

　　

INTRODUCTION

全球多重耐药（MDR）病原体危机日益严峻，世界卫生组织（WHO）将ESKAPE病原体（包括碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌CRAB和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA）列为最高优先级威胁。传统抗生素研发陷入瓶颈，而抗菌肽（AMPs）因其独特膜靶向机制成为研究热点。研究团队前期开发的蛋白质序列大语言模型ProteoGPT及其衍生工具AMPGenix，通过迁移学习生成具有抗菌潜力的肽段模板，为加密肽的发现奠定基础。

RESULTS

加密肽的发现与特性

以AMPGenix生成的g_AMP41（WLKKILKWLKW）为模板，通过NCBI数据库比对鉴定出5种加密肽（PL-15、AT-10、GT-11、BR-13、PD-9）。这些肽段源自普雷沃菌属（Prevotella）等微生物的膜相关蛋白，具有60%-90%序列相似性。AlphaFold预测显示其均呈α-螺旋结构，但长度（9-15个氨基酸）和分子量（平均1570.99 Da）显著小于已知抗菌肽（k_AMPs）。值得注意的是，PL-15富含赖氨酸（K）和疏水性氨基酸（如色氨酸W），净电荷+3.7，疏水比达40%，这种特殊组成使其在五种AMP预测模型中均获高分。

PL-15的广谱抗菌活性

体外实验显示，PL-15对8种临床菌株（包括CRAB和MRSA）的MIC值低至2-4 μg mL^?1，优于47种已知抗菌肽中的80%。尤其对CRAB感染的小鼠大腿模型，PL-15（10×MIC）与多粘菌素B相当，24小时内清除97%细菌（P=0.0013）。其快速杀菌特性在时间-杀灭曲线中尤为突出：2×MIC浓度下3小时即可完全清除CRAB，而多粘菌素B需6小时。

作用机制的多维解析

分子动力学（MD）模拟揭示，PL-15的N端色氨酸（Trp）和异亮氨酸（Ile）会插入POPE/POPG膜（模拟细菌膜），引发膜结构重排。实验证实其通过三重机制杀菌：

1. 1.

   膜破坏：10×MIC时NPN荧光强度激增（外膜渗透性增加），PI实验显示1×MIC即可破坏胞膜完整性；

2. 2.

   膜电位瓦解：DiSC₃-(5)检测显示10×MIC引起快速去极化；

3. 3.

   代谢干扰：DCFH-DA探针检测到活性氧（ROS）水平升高，而抗氧化剂NAC可部分中和其杀菌效果。

抗生物膜与低耐药性

PL-15在4×MIC时能抑制75%生物膜形成，并清除成熟生物膜。连续20代亚抑菌浓度传代后，CRAB对PL-15的MIC仅波动2倍，而多粘菌素B耐药性提升64倍，凸显其临床转化潜力。

DISCUSSION

本研究开创的"生成-比对"策略突破了传统肽设计依赖经验规则的局限。AMPGenix提供的先验知识显著提升了加密肽发现效率，PL-15的多重作用机制使其成为对抗MDR病原体的理想候选。未来可通过氨基酸替换优化生物相容性，或截取最小功能片段降低成本。该工作为AI驱动抗菌药物研发提供了范式转移。

MATERIALS AND METHODS

关键技术包括：NCBI BLAST序列比对、AlphaFold结构预测、CHARMM36m力场MD模拟（200 ns）、微量肉汤稀释法（MIC/MBC测定）、荧光探针（NPN/PI/DiSC₃-(5)）实时监测膜损伤，以及小鼠中性粒细胞减少 thigh infection模型（环磷酰胺预处理150/100 mg kg^?1）。所有实验均设三重生物学重复。