托珠单抗（TCZ）与犬IL-6受体结合及其体外抑制生物学效应的机制研究

本研究首次证实人源化单抗（mAb）托珠单抗（TCZ）可与犬白细胞介素-6受体（IL-6R）结合，并通过流式细胞术检测STAT3磷酸化（p-STAT3）证实其体外抑制效应。表面等离子共振（SPR）显示犬IL-6R结合亲和力较人源低两个数量级（KD=203.9 nM），需更高TCZ浓度（500 μg/mL）才能达到类似抑制效果，为跨物种mAb疗法开发提供新思路。

　　

1 引言

自身免疫疾病在人类与兽医领域均需突破性治疗手段。传统疗法如糖皮质激素长期使用副作用显著，而单克隆抗体（mAb）因其高特异性成为研究热点。托珠单抗（TCZ）作为靶向白细胞介素-6受体（IL-6R）的人源化mAb，已获批用于人类类风湿关节炎，但其在犬类中的应用潜力尚未明确。犬与人类IL-6R序列相似度达74%，但关键结合域差异可能影响TCZ疗效，这为跨物种mAb疗法开发提出挑战。

2 材料与方法

2.1 细胞培养与流式分析

采用犬巨噬细胞系DH82与人单核细胞系U-937，通过检测STAT3酪氨酸705位点磷酸化（p-STAT3 Y705）评估TCZ抑制效应。结果显示：人源细胞仅需10 μg/mL TCZ即可显著降低p-STAT3（p<0.05），而犬细胞需500-2000 μg/mL才能达到同等效果。

2.2 同源建模与结构分析

通过MODELLER软件构建犬IL-6R的D2-D3结构域模型，发现其结合环区34个氨基酸中28个（82%）具有保守性，但关键位点如D3域电荷差异可能削弱TCZ结合。

2.3 表面等离子共振（SPR）

TCZ与犬IL-6R的解离常数（K_D=203.9 nM）较人源（K_D=9.9 nM）弱200倍，动力学分析显示更快的解离速率（k_off）与更慢的结合速率（k_on）。

3 结果

3.1 生物学效应验证

FSEC与SDS-PAGE证实TCZ-犬IL-6R复合物形成，但需超高浓度（2000 μg/mL）才能抑制STAT3通路，暗示临床剂量可能不切实际。

3.2 冷冻电镜技术瓶颈

尝试通过冷冻电镜解析复合物结构时，颗粒聚集导致成像失败，提示犬IL-6R可能存在构象不稳定性。

4 讨论

尽管TCZ在犬细胞中展现剂量依赖性抑制，但其低亲和力与高成本限制直接临床应用。研究首次揭示跨物种mAb疗法的可行性障碍：即使序列相似度高，细微构象差异仍可导致结合效能显著下降。未来或需针对犬类特异性改造mAb，或筛选现有库中亲和力更优的人源化抗体。

5 结论

TCZ对犬IL-6R的弱结合性为跨物种mAb开发敲响警钟，但同源建模与SPR技术的结合为快速评估候选药物提供方法论支持。突破物种屏障需兼顾结构生物学与临床转化研究。