靶向EGFR与VEGF-A的CrossMab/KIH双特异性抗体的理化与生物学特性研究及其在卵巢癌治疗中的协同机制

这篇研究通过CrossMab/KIH技术构建了同时靶向EGFR和VEGF-A的双特异性抗体（BsAb），系统评估了其理化性质（SEC-HPLC、CE-SDS）、结合活性（ELISA、SPR）及功能机制（阻断EGFR/VEGFR2信号通路）。该BsAb在卵巢癌（OC）模型中展现出双重抑制效应：直接阻断肿瘤细胞EGFR信号，同时通过抑制VEGF-A介导的旁分泌激活内皮细胞VEGFR2通路，为克服OC耐药性提供了新策略。

　　

引言

双特异性抗体（BsAbs）通过同时靶向两个抗原表位，在肿瘤治疗中展现出独特优势。本研究基于CrossMab（免疫球蛋白域交叉）和KIH（杵臼结构）技术，构建了靶向表皮生长因子受体（EGFR）和血管内皮生长因子A（VEGF-A）的BsAb。卵巢癌（OC）中EGFR与VEGF-A通路常共激活，但单靶点疗法易耐药。该BsAb通过协同阻断两条通路，有望突破治疗瓶颈。

材料与方法

采用HEK293细胞瞬时表达系统，将源自西妥昔单抗（cetuximab）和法瑞西单抗（faricimab）的基因序列改造为CrossMab^CH1-CL格式，并通过KIH突变（T391W/T391S_L393A_Y432V）确保重链异源二聚化。通过SDS-PAGE、SEC-HPLC和毛细管电泳（CE-SDS）评估纯度；ELISA和表面等离子共振（SPR）检测结合活性；OC细胞（SKOV3、CaOV3）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）模型验证功能。

结果

1. 结构验证

非还原SDS-PAGE显示BsAb主条带约150 kDa，还原条件下可见50 kDa重链和25 kDa轻链（图1B）。SEC-HPLC显示单一峰（纯度>96%），但非还原CE-SDS中73.8%纯度提示可能存在天然亚基解离（图1C-D）。

2. 双重结合活性

ELISA证实BsAb对VEGF-A和EGFR的EC₅₀分别为1.85 ng/mL和3.98 ng/mL（图2A），同步结合EC₅₀为56.13 ng/mL（图2B）。SPR测得其与EGFR/VEGF-A的解离常数（K_D）分别为1.78×10^?9 M和1.72×10^?10 M（表1），与亲本单抗相当。

3. 信号通路抑制

在OC细胞中，BsAb阻断EGF诱导的EGFR（Y1086）和VEGFR2（Y1059）磷酸化（图4B、5B）。值得注意的是，EGF单独激活VEGFR2磷酸化，提示通路串扰（图5B）。HUVEC实验中，BsAb通过中和OC细胞分泌的VEGF-A（SKOV3分泌量~300 pg/mL，图6F），抑制旁分泌激活的VEGFR2/Y1054磷酸化及下游FAK/Akt信号（图6E-G）。

4. 热稳定性

42°C应激336小时后，SEC-HPLC和SDS-PAGE未检测到降解，ELISA结合活性保持稳定（图3A-D），证实CrossMab/KIH格式的稳定性。

讨论

该BsAb通过“组合模式”同时抑制EGFR和VEGF-A通路：

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  直接作用：阻断OC细胞EGFR信号，抑制增殖；

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  间接作用：干扰VEGF-A介导的血管生成，克服微环境耐药。

  研究首次揭示EGF可激活OC细胞VEGFR2，为靶向联合策略提供新依据。未来需开发双arm生物活性检测方法以支持质量控制。

创新点

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  首次将CrossMab/KIH技术应用于EGFR/VEGF-A双靶点；

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  发现EGF-VEGFR2串扰在OC中的新机制；

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  为OC耐药提供了“一箭双雕”的治疗策略。