综述：人类来源粪便微生物悬液用于粪便微生物群移植的实验室制备方法：综述与标准化展望

这篇综述系统评述了粪便微生物群移植(FMT)中关键步骤——粪便悬液制备的实验室方法，涵盖样本采集、缓冲液选择、均质化、纯化(过滤/离心)、冻存等全流程，为建立标准化操作程序(SOP)提供参考，尤其强调厌氧环境对维持菌群活性(如Faecalibacterium prausnitzii)和临床疗效的重要性。

　　

1 引言

人类肠道菌群作为"第二基因组"，其失衡与多种疾病密切相关。粪便微生物群移植(FMT)通过重建肠道微生态发挥治疗作用，但制备方法的差异导致疗效波动。当前亟需标准化流程，以满足监管要求（如FDA对Rebyota和Vowst等FMT产品的审批）并提升临床转化潜力。

2 样本采集

推荐使用无菌工具采集≥50g新鲜粪便，避免血液/尿液污染。运输需在4°C下6小时内完成（"FMT 1小时协议"最佳），室温存放>24小时会导致菌群结构改变（如放线菌增加/厚壁菌减少）。啮齿类实验多采用粪粒或胃肠道内容物。

3 悬浮缓冲液

磷酸盐缓冲液(PBS)因pH稳定性成为主流选择，添加0.05g/L L-半胱氨酸可保护厌氧菌。智能处理系统仍采用生理盐水，粪便与缓冲液比例建议1:3-1:10(w/v)。He等提出的25%粪便+60%盐水+15%甘油方案能优化菌群活性。

4 均质化

粪便空间异质性要求充分均质。方法包括：手动（研钵）、震荡（Vortex-Genie 2）、机械（FLUKO搅拌器）等，但缺乏统一标准。自动搅拌分离机可实现标准化处理。

5 纯化

5.1 过滤

依次通过2.0mm→0.25mm不锈钢筛网可去除颗粒物，多层过滤减少堵塞。注意细菌尺寸（0.89-1.4μm直径，聚集体达4μm）。

5.2 离心

参数差异显著：400×g去除大颗粒后，6000×g收集菌群（Hamilton法）。高离心力(>8000×g)会损伤细菌，需平衡回收率与活性。密度梯度离心适用于特定菌群分离。

6 冷冻保存

-80°C（6个月）优于-20°C（1个月），解冻建议37°C水浴5分钟。10%甘油能稳定菌群结构，但冻干制剂推荐5%海藻糖+麦芽糊精组合，存活率媲美新鲜样本。

7 剂量

临床单位剂量需≥10¹³ CFU，结肠镜移植每次1-5单位（1单位=1.0×10¹³菌）。新型检测技术（如微流控数字CFU、PMA-qPCR）比传统培养法更准确。

8 操作环境

氧气暴露2分钟即导致50%厌氧菌死亡（如Faecalibacterium prausnitzii）。推荐使用AnaeroPack?除氧剂和厌氧工作站，维持氧浓度<0.1%。

9 移植方式

悬液：适合快速移植但需冷链；胶囊：冻干工艺使室温稳定12个月，患者依从性高。研究显示胶囊对艰难梭菌复发预防更优（79.7% vs 53.3%），但肠易激综合征推荐灌肠法。

10 结论

建立从采集到移植的全流程SOP至关重要，未来需结合菌群-代谢组动态监测实现精准质控。不同疾病可能需要定制化给药途径，这将成为标准化研究的下个焦点。