塑化剂代谢物MEHP通过调控CTSD/VCP-凋亡通路抑制骨髓基质细胞成骨分化的机制研究

本研究通过队列分析与网络毒理学方法，首次揭示塑化剂代谢物单(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯(MEHP)与骨质疏松症(OP)的正相关性。基于NHANES数据库2,846例样本证实MEHP暴露剂量与OP风险呈非线性递增关系（OR=4.228，p<0.001），结合GSE56815数据集筛选出19个交叉靶点，通过机器学习锁定CTSD、VCP、SOAT1三个关键靶点。分子对接显示MEHP与靶蛋白结合能达-6.7kcal/mol，分子动力学模拟证实复合物RMSD稳定在0.217-0.604nm。细胞实验证实500ng/mL MEHP通过下调CTSD/VCP表达，显著抑制小鼠骨髓基质细胞(BMSCs)成骨分化（ALP、COL1、RUNX2、BMP2降低），而SOAT1与成骨相关性较弱。该研究为环境污染物致OP提供了新的分子机制和干预靶点。

　　

1 Introduction

塑化剂作为广泛使用的工业添加剂，其中邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)曾占市场份额70%以上，其代谢产物MEHP可通过食物链、空气和皮肤接触进入人体。近年研究发现塑化剂与生殖障碍、代谢疾病相关，但关于骨质疏松症(OP)的研究仍存在空白。OP作为老龄化社会重大健康问题，其发病与环境污染物暴露的关联亟待阐明。本研究通过多组学方法探索MEHP影响骨代谢的分子机制，为环境因素致OP提供新证据。

2 Methods

2.1 临床队列分析

基于NHANES 2013-2018周期数据，筛选2,846名20岁以上受试者。采用HPLC-ESI-MS/MS检测尿MEHP浓度（LLOD=0.8ng/mL），通过DXA测定股骨颈BMD定义OP（WHO标准）。建立三个逐步校正的logistic回归模型，并采用限制性立方样条(RCS)分析剂量-效应关系。

2.2 网络毒理学

从GEO获取GSE56815数据集（40例OP/40对照），通过limma包筛选DEGs（|log2FC|>0.1）。联合SwissTargetPrediction、SEA等数据库预测MEHP靶点，获得19个交叉基因后进行GO/KEGG富集分析。使用String构建PPI网络，通过CytoHubba的Betweenness、Degree等算法筛选hub基因，结合Boruta、LASSO、SVM-RFE机器学习最终确定关键靶点。

2.3 实验验证

采用AutoDock Vina进行分子对接（结合能阈值-5kcal/mol），GROMACS 2020.6进行100ns分子动力学模拟，分析RMSD、Rg等参数。分离新生小鼠BMSCs，通过CCK8确定MEHP作用浓度（500-700ng/mL），ALP染色、qPCR和WB检测成骨标志物（COL1、RUNX2、BMP2）及靶蛋白表达。siRNA敲低验证CTSD/VCP功能。

3 Results

3.1 队列研究

最高MEHP四分位数组OP风险增加3.65倍（95%CI:2.02-6.60），RCS显示非线性正相关（p=0.0089）。多因素校正后Q4组OR达4.23（95%CI:2.11-8.46）。

3.2 机制探索

KEGG分析显示凋亡通路显著富集（p<0.05）。机器学习筛选出CTSD、VCP、SOAT1三个关键靶点，构建的nomogram预测AUC达0.868。分子对接显示MEHP与VCP结合能-6.4kcal/mol，形成氢键于Gly521/Ser524位点。MD模拟中VCP-MEHP复合物RMSD稳定在0.317±0.063nm，MM/GBSA结合自由能-29.79kcal/mol。

3.3 细胞实验

500ng/mL MEHP处理7天使BMSCs成骨分化能力显著降低：ALP活性下降47%，COL1 mRNA减少2.1倍（p<0.01）。WB显示CTSD/VCP蛋白表达下调60%，而siCTSD处理组RUNX2蛋白降低55%，ALP染色减弱。SOAT1与成骨标志物无显著相关性。

4 Discussion

本研究首次揭示MEHP通过干扰CTSD/VCP-凋亡通路损害BMSCs成骨分化的分子机制。CTSD作为溶酶体蛋白酶，其下调可能影响自噬-溶酶体系统，而VCP突变已知与Paget骨病相关。值得注意的是，虽然SOAT1在胆固醇代谢中起关键作用，但其与成骨分化关联性较弱，提示MEHP可能主要通过非脂代谢途径影响骨稳态。研究局限性在于未探讨MEHP对破骨细胞的影响，未来需结合动物模型验证。随着环保法规完善，开发新型无毒塑化剂将成为减少OP环境风险的重要方向。