烟草本氏体中异源表达赛普蛋白B：揭示植物特异性插入结构域在蛋白质功能与亚细胞定位中的作用

这篇研究通过农杆菌浸润法在烟草本氏体（Nicotiana benthamiana）中高效表达赛普蛋白B（CYPB）及其缺失植物特异性插入结构域（PSI）的变体（CYPBΔPSI），揭示了PSI结构域在酶活性、产量及液泡靶向中的关键作用。研究发现，CYPBΔPSI的蛋白酶活性（168 IU/mg）显著高于CYPB（57 IU/mg），且乳凝时间更短，表明PSI的移除可提升酶效率。亚细胞定位显示PSI主导液泡分选，而缺失后蛋白滞留于内质网（ER）。该研究为植物平台生产乳凝酶提供了新策略，并阐明了PSI结构域的多功能机制。

　　

1 引言

奶酪生产的核心步骤依赖于特定蛋白水解酶的催化活性，传统动物源凝乳酶（含凝乳酶EC 3.4.23.4）因伦理与供应限制促使植物源替代品开发。菊蓟（Cynara cardunculus）花提取物中的天冬氨酸蛋白酶（APs）如赛普蛋白（CYP）和卡多辛（cardosin）具有类似凝乳活性，但其工业化应用受限于野生植株变异性和低产量。赛普蛋白B（CYPB）作为关键成员，含104个氨基酸的植物特异性插入结构域（PSI），其功能长期未明。微生物表达系统（如毕赤酵母）常因错误折叠和低分泌导致失败，而烟草本氏体的真核修饰能力为高效生产提供了新可能。

2 结果

2.1 结构特征分析

CYPB的PSI结构域与人类鞘脂激活蛋白C（saposin C）具有相似α螺旋和疏水斑块（如Met₃₁₉和Trp₃₂₃），暗示其参与膜相互作用。合成衍生物“交换蛋白”（swaposin）通过删除内部环（G₂₈₇-V₃₁₀）保留类似结构，验证了PSI的稳定性维持功能。

2.2 表达与产量

瞬时表达显示，CYPBΔPSI转录水平在3 dpi时较CYPB高9倍，但蛋白产量较低（60 vs. 81 mg/kg鲜重）。Western blot证实CYPB经糖基化（PNGase F敏感）和蛋白酶切割生成37 kDa成熟亚基，而PSI缺失导致蛋白滞留ER。

2.3 酶学特性

CYPBΔPSI在pH 4.6和47°C下活性最优，且乳凝时间（3分15秒）较CYPB（5分30秒）显著缩短。抑制实验证实胃酶抑素A（pepstatin A）可完全阻断活性，验证其APs特性。

2.4 亚细胞定位

荧光标记显示，完整CYPB定位于液泡和内吞小体（与FM4-64/MDY-64共定位），而PSI单独表达亦呈现液泡靶向。CYPBΔPSI则滞留于ER和液泡膜，表明PSI是液泡分选的决定性因素。

3 讨论

PSI结构域通过介导COPII依赖的ER-高尔基体运输或高尔基旁路途径实现液泡靶向，其缺失导致ER滞留和产量下降。尽管CYPBΔPSI活性更高，但液泡的“保护性环境”更利于蛋白稳定积累。植物表达系统克服了微生物宿主糖基化缺陷，为规模化生产奠定基础。

4 实验方法

研究采用pEAQ-HT载体在烟草本氏体中瞬时表达，通过IMAC纯化蛋白。酶活测定使用FITC标记κ-酪蛋白，乳凝实验以脱脂乳为底物。共聚焦显微镜结合FM4-64/MDY-64染色解析定位机制。

5 结论

该研究首次在植物中实现功能性CYPB生产，阐明PSI结构域的双重角色：虽非催化必需，却是液泡分选和产量优化的关键。烟草平台的高效表达（81 mg/kg）为植物源乳凝酶的商业化提供了技术支撑。