沉香MYB类转录因子AsMYB1通过互作14-3-3蛋白AsGRF1促进2-(2-苯乙基)色酮生物合成的分子机制研究

（编辑推荐）本研究首次揭示沉香（Aquilaria sinensis）中1R亚型MYB转录因子AsMYB1通过特异性结合AsPECPS启动子MBS元件激活2-(2-苯乙基)色酮（PECs）生物合成，并与14-3-3家族蛋白AsGRF1互作增强其转录活性、核定位及稳定性，构建了AsGRF1-AsMYB1-AsPECPS模块协同调控盐胁迫诱导的沉香树脂形成机制，为沉香品质改良提供新策略。

　　

1 引言

沉香作为瑞香科（Thymelaeaceae）植物响应外界胁迫形成的珍贵树脂，其核心活性成分2-(2-苯乙基)色酮（PECs）具有抗炎、抗菌、神经保护等多元药理活性。前期研究发现聚酮合酶AsPECPS催化PECs骨架C₆-C₅-C₆形成，但调控网络仍不明确。本研究聚焦1R-MYB转录因子家族，通过多组学分析揭示AsMYB1与AsGRF1协同调控PECs合成的分子机制。

2 结果

2.1 鉴定调控PECs合成的1R-MYB转录因子

盐胁迫转录组筛选获得14个1R-MYB基因，其中AsMYB1（含SHAQKYF保守域）与AsPECPS表达相关性最高（Pearson's r=0.94）。系统发育分析显示其属于CCA1-like2亚组，与大豆异黄酮调控因子GmMYB133同源。亚细胞定位证实AsMYB1兼具核质分布特性，转录激活实验表明其具有强反式激活能力。

2.2 AsMYB1正向调控PECs积累

遗传操作实验显示：过表达AsMYB1使悬浮细胞中PECs总量提升3.18倍（PEC-1/2/5分别增加2.17-3.64倍）；而RNAi和CRISPR/Cas9敲除则使PECs降至野生型15.6%，证实其正向调控作用。

2.3 AsMYB1特异性激活AsPECPS转录

酵母单杂交和EMSA实验证实AsMYB1结合AsPECPS启动子MBS1（CAACTG）和MBS2/3（ATTACCAA/AAAAGAAT）元件。双荧光素酶报告系统显示其使启动子活性增强4.8倍，ChIP-qPCR验证体内结合效率提升3.2倍。

2.4 AsMYB1与AsGRF1互作特征

质谱筛选发现14-3-3家族蛋白AsGRF1（含9个α-螺旋）为互作候选。LCI和BiFC实验显示互作信号定位于细胞质，GST pull-down测得结合常数K_d=2.3 μM。值得注意的是，三个预测的pST结合基序突变未影响互作，提示存在非典型结合模式。

2.5 AsGRF1增强AsMYB1功能

共过表达AsMYB1/AsGRF1使PECs产量较单过表达提高42%，而双敲除使AsPECPS表达量降至9.7%。机制研究表明：

1）AsGRF1使AsMYB1核定位比例从38%增至67%

2）细胞降解实验显示AsGRF1使AsMYB1半衰期延长2.3倍

3）蛋白酶体抑制剂MG132处理证实其通过泛素-26S途径稳定AsMYB1

3 讨论

本研究首次构建"14-3-3-MYB-靶酶"三级调控模块：

1）进化分析揭示AsMYB1属于植物特异的CCA1-like/R-R型MYB亚家族，其通过MBS元件直接激活AsPECPS表达，拓展了1R-MYB调控次生代谢的认知边界

2）发现14-3-3蛋白AsGRF1通过非经典方式（不依赖pST基序）与AsMYB1互作，形成"分子支架"增强转录复合体稳定性

3）提出盐胁迫下AsGRF1介导的"核穿梭-蛋白稳定-转录增效"三重调控模型，为解释环境胁迫诱导沉香形成提供新视角

该发现不仅为沉香品质分子育种提供AsMYB1/AsGRF1关键靶点，其揭示的"转录因子-支架蛋白"协同调控机制为植物特殊代谢物合成调控研究提供范式。未来可基于此开发代谢工程策略，实现PECs的定向增产。