基于全氟化碳液体通气与组织透明化技术的肺泡深部成像深度比较研究

这篇研究通过对比全氟化碳（PFC）液体通气与组织透明化技术（如SeeDB和CUBIC）在小鼠肺深部成像中的应用，揭示了肺泡气-液界面折射率（RI）不匹配并非限制成像深度的唯一因素。研究发现，PFC虽能均匀递送纳米颗粒并实时观察其与肺泡上皮的相互作用，但仅靠RI匹配无法显著提升成像深度；而结合去脂化（delipidation）和脱色（decolorization）的CUBIC技术可突破光学限制，为肺部疾病研究和吸入式给药优化提供新视角。

　　

1 引言

哺乳动物肺部作为气体交换与免疫防御的关键器官，其高分辨率活体成像长期受限于呼吸运动与肺泡气-液界面的光散射。尽管多光子显微镜等技术已用于研究中性粒细胞抗菌反应或肿瘤转移，但成像深度通常局限在100 μm以内，阻碍了对哮喘等深部气道疾病的观察。传统理论将这一限制归因于肺泡内空气（RI 1.00）与肺组织（RI 1.30–1.41）的折射率失配。为验证此假说，研究团队设计了两套方案：一是通过氧合全氟化碳（PFC，RI 1.291）液体通气消除气-液界面；二是采用离体组织透明化技术（如SeeDB和CUBIC）结合光片显微镜，系统性评估RI匹配与去脂化对成像的影响。

2 材料与方法

2.1 活体成像与纳米颗粒递送

实验采用C57BL/6和LysM-eGFP转基因小鼠，通过定制化3D打印显微适配器实现倒置显微镜下的肺脏稳定成像。创新性设计的气管插管集成PE-10导管，可在机械通气同时灌注PFC悬浮的50 nm红色荧光硅颗粒（PSi-R0.05）。重力辅助灌注配合100%氧气预通气确保PFC抵达肺泡远端，并通过纳米颗粒分布验证填充效果。

2.2 组织透明化

对比两种方案：SeeDB仅通过果糖溶液提升RI至1.485；CUBIC则结合尿素/ Triton X-100去脂化与蔗糖溶液RI匹配（1.484）。光片显微镜成像前，采用α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体和碘化丙啶（PI）分别标记气道结构与细胞核。

3 结果

3.1 PFC实现肺泡均匀填充

荧光纳米颗粒动态分布证实PFC可有效抵达肺泡，并黏附于肺泡壁。实时成像显示颗粒在5分钟内完成均匀分布，为纳米药物递送研究提供可视化工具。

3.2 成像深度未显著改善

尽管PFC填充使肺泡表面散射减少（图3），但共聚焦与多光子显微镜的穿透深度仍局限在115 μm（图4）。值得注意的是，中性粒细胞eGFP信号虽清晰可见，但需逐层对比度调整才能识别深层信号。

3.3 去脂化是关键突破点

离体实验揭示：仅RI匹配的SeeDB样品仅能成像50 μm深度（图5A/C），而CUBIC处理后的肺组织可清晰显示数百微米级的平滑肌网络（图6D-F）。视频重建进一步证实，去除肺表面活性物质（含90%脂质）是提升穿透深度的核心因素。

4 讨论

研究颠覆了传统认知——肺泡RI失配并非限制深部成像的唯一瓶颈。PFC液体通气虽未能突破活体成像的深度极限，但其均质化纳米颗粒递送的特性为吸入式给药研究开辟新途径。而CUBIC技术的成功提示，肺泡表面活性物质的脂质成分（如二棕榈酰磷脂酰胆碱）产生的强散射效应需通过化学去脂才能克服。这一发现与有机溶剂透明化（如BABB）的深层成像结果相呼应，但后者因组织收缩和荧光淬火限制其活体应用。

5 结论

研究首次系统论证了肺部深部成像的双重壁垒：气-液界面RI失配与肺泡脂质散射。虽然PFC液体通气为纳米药物动力学研究提供创新平台，但突破穿透深度需依赖组织透明化中的去脂化步骤。未来或可通过自适应光学技术结合新型造影剂，在活体环境中实现更深层次的肺部动态观测。

（注：全文数据均源自原文实验，图示引用已按需简化，专业术语如RI、PFC、α-SMA等均保留标准缩写格式与上下标规范）