尼日利亚菌素触发的磷酸化动态在炎症小体形成与细胞焦亡中的调控机制及免疫代谢重编程研究

这篇综述通过时间分辨磷酸化蛋白质组学，系统解析了炎症小体触发剂尼日利亚菌素（nigericin）诱导的激酶信号网络动态变化。研究揭示了MAPK、PKC等关键激酶通路的时序性激活模式，阐明了磷酸化修饰在免疫代谢重编程（immunometabolism）、DNA损伤应答及染色质重构中的调控作用，为靶向炎症小体依赖性IL-1β释放的慢性炎症疾病治疗提供了新靶点。

　　

ABSTRACT

先天免疫信号传导高度依赖磷酸化级联反应。本研究通过时间分辨磷酸化蛋白质组学，揭示了尼日利亚菌素触发炎症小体后激酶信号的动态变化。研究发现，尼日利亚菌素能快速诱导免疫相关信号（如MAPK、PKC通路）的磷酸化重编程，并显著影响代谢通路磷酸化修饰。这些事件先于DNA损伤和染色质重构蛋白的磷酸化，最终导致细胞焦亡性破裂。通过时序聚类分析，研究首次揭示了炎症触发后磷酸化信号在细胞早期和晚期炎症事件中的阶段性转变。

1 Introduction

蛋白质可逆磷酸化是细胞应对稳态失衡的核心调控机制。尽管Toll样受体（TLR）信号通路的磷酸化动态已被广泛研究，但炎症小体触发后的磷酸化调控网络仍不明确。经典炎症小体激活需要"双信号"系统：TLR刺激提供转录 priming，而尼日利亚菌素等应激原通过NLR蛋白激活ASC支架，最终导致caspase活化和IL-1β释放。近期研究发现，NLRP3和ASC支架蛋白的磷酸化位点具有双向调控作用，提示炎症小体形成需要精确的"许可"机制。MAPK家族激酶的时序性激活模式与炎症小体形成和焦亡进程密切相关，这为解析炎症反应的阶段性调控提供了线索。

2 Materials and Methods

实验采用PMA分化的U937巨噬细胞模型，通过KLA（KDO-Lipid A）priming 18小时后，用10 μM尼日利亚菌素处理不同时间（15-180分钟）。蛋白质组学分析采用8 M尿素裂解，经TiO₂和Fe-NTA柱分级富集磷酸化肽段，Orbitrap Fusion Eclipse质谱仪进行DDA采集。数据分析采用Proteome Discoverer 3.1，通过KNN算法填补缺失值，WebGestalt进行通路富集，并运用模糊C均值聚类解析时序动态。细胞学验证包括ASC speck成像、Draq7膜通透性检测和毛细管凝胶电泳（CGE）分析IL-1β切割。

3 Results

3.1 模型验证与数据质控

ASC speck成像显示尼日利亚菌素处理1小时内即形成明显炎症小体，而Draq7摄取实验表明细胞焦亡始于2小时左右（图1C,D）。质谱数据经归一化处理后，PC1方差从30.1%降至4.1%（图1F）。在4574个检测蛋白中，KLA priming主要上调IL-1β（1.85%）和下调FAS（2.71%）（图2A），而尼日利亚菌素触发仅引起0.6%蛋白显著变化（图2C）。

3.2 磷酸化动态特征

磷酸化位点定位准确率达80%（图3A）。早期（30分钟）磷酸化主要富集于糖酵解/TCA循环（如IDH2、SDHB）和凋亡调控蛋白（如APIP），而晚期（120分钟）则转向DNA损伤应答（如H2AX、PARP1）和TORC信号（图3B-D）。代谢通路蛋白在60分钟出现磷酸化峰值后急剧下降，提示线粒体功能障碍（图4A-C）。相反，mTORC1/2组分（RICTOR、RPTOR）持续磷酸化，可能与GSDMD孔道形成相关（图4D）。

3.3 染色质重构与激酶网络

475个染色质相关蛋白在焦亡期（120-180分钟）呈现显著磷酸化，其中动态调控蛋白（如HMGN、HMGB）比结构蛋白更活跃（图5A-C）。激酶底物分析显示，p38α（MAPK14）、ASK1（MAP3K5）和PKCβ/δ在晚期特异性激活（图5E），而ERK3/6（MAPK4/6）主导早期响应（图5D），这种双相模式可能分别调控炎症小体组装和焦亡执行。

4 Discussion

本研究首次绘制了炎症小体触发后的全蛋白质组磷酸化动态图谱。主要发现包括：① 代谢通路（糖酵解/TCA）磷酸化在60分钟达峰后骤降，与线粒体去极化一致；② TORC信号持续激活可能通过AKT调控GSDMD；③ 染色质重构蛋白的爆发式磷酸化提示焦亡伴随程序性DNA降解。这些发现为靶向特定炎症阶段（如MAPK14抑制早期炎症、TORC2干预晚期焦亡）提供了理论依据。未来研究可深入探索磷酸化修饰如何协调代谢重编程与细胞死亡抉择，为败血症、自身炎症性疾病等提供精准治疗策略。

（注：全文严格依据原文实验数据归纳，未添加非文献支持内容；专业术语如MAPK、PKC等均保留英文缩写；上下标如IL-1β、CO₂等按原文规范呈现）