端粒酶缺失条件下酿酒酵母Naumovozyma castellii亚端粒元件TelKO维持短端粒稳定的分子机制研究

本研究针对端粒酶缺失细胞中端粒维持的替代机制展开探索，发现酿酒酵母Naumovozyma castellii通过亚端粒元件TelKO的扩散实现短端粒稳定。研究人员通过全基因组测序和TRF分析揭示TelKO445和TelKO220两种变体在ALT途径中的同质化作用，证实端粒结合蛋白Rap1可识别TelKO序列形成保护性染色质帽。该研究为理解端粒酶非依赖性维持机制提供了新视角，发表于《Current Genetics》。

　　

在真核生物中，端粒（telomere）作为染色体末端的保护帽，其长度维持关乎细胞衰老与癌变命运。传统认知中，端粒酶（telomerase）是端粒延伸的核心执行者，但约10-15%的肿瘤细胞通过端粒酶非依赖性替代延长途径（Alternative Lengthening of Telomeres, ALT）实现永生。这一现象在模式生物酿酒酵母中已有研究，但不同物种的ALT机制存在显著差异。Naumovozyma castellii作为一种特殊的芽殖酵母，其端粒酶缺失后展现出独特的生存策略——不经历典型衰老危机即可建立稳定ALT表型，这为探索端粒维持的进化多样性提供了理想模型。

研究人员发现N. castellii ALT细胞的端粒并非无序延长，而是稳定维持在约350 bp的短小均一结构。通过全基因组测序和端粒限制性片段（Terminal Restriction Fragment, TRF）分析，团队鉴定出两种亚端粒元件TelKO变体：445 bp的TelKO₄₄₅和其截短版本220 bp的TelKO₂₂₀。令人惊讶的是，每种ALT细胞系会选择性扩增特定TelKO变体，使其扩散至所有染色体末端，形成基因组水平的序列同质化。这种"赢家通吃"现象通过PacBio测序得到验证——在测序的ALT株系中，所有端粒均携带完全相同的TelKO₂₂₀等位基因。

关键实验技术包括：连续传代培养观察长期稳定性、TRF分析监测端粒动态、BAL-31核酸酶消化验证末端定位、Telomere-PCR结合Sanger测序解析末端序列、PacBio全基因组测序组装端粒区域、EMSA验证Rap1蛋白与TelKO结合特性。

Subtelomeric elements provide stability to short telomeres

研究发现ALT细胞中短端粒结构的稳定性与TelKO元件直接相关。TRF分析显示，携带TelKO₂₂₀的株系产生350 bp特征条带，而TelKO₄₄₅株系因内部HinfI酶切位点呈现200 bp条带。BAL-31时间梯度实验证实这两种元件均定位于染色体最末端，且ALT细胞中该定位特征得以保留。

Different TelKO element variants can stabilize ALT telomeres

群体克隆筛查揭示惊人的结构稳定性——同一传代批次中所有克隆均保持完全相同的端粒结构。全基因组测序发现野生型菌株原本分散的TelKO变体在ALT细胞中被单一变体取代，例如测序株系中所有端粒均携带TelKO₂₂₀(C等位基因)。这种同质化暗示存在高效的模板转换机制。

Telomeres are elongated by homogeneous tandem arrays

尽管短端粒占主导，约7%的样本出现阶梯状TRF条带，对应TelKO元件的串联重复。高通量测序揭示这些阵列由325 bp高阶重复单元构成，包含TelKO₂₂₀及其侧翼序列（13 bp部分TelKO片段和35 bp端粒重复）。不同株系阶梯间距的差异表明存在多种复合重复单元构型。

Rap1 can bind to TelKO elements

EMSA竞争实验证明端粒结合蛋白Rap1能以低亲和力结合TelKO中的TG富集区（如ST-4位点，含6 bp间质端粒序列）。这种结合虽弱于典型端粒序列40-90倍，但在端粒缩短导致高亲和位点减少时，可能促进保护性染色质帽向亚端粒区扩展。

该研究首次系统阐明亚端粒元件在ALT途径中的双重功能：既作为重组模板产生长阵列，又能通过序列同质化维持短端粒稳定。特别值得注意的是，TelKO元件的TG富集特性使其可被Rap1识别，这为理解短端粒如何避免降解提供了结构基础。作者Marita Cohn团队提出"染色质帽内扩"假说——当端粒缩短至临界长度时，Rap1协同结合残余端粒和TelKO序列，形成非经典保护结构。这一发现不仅拓展了对酵母ALT机制的认识，也为研究人类肿瘤细胞的端粒维持策略提供了新思路。