基于dCas9的转录干扰策略激活神经元中父源UBE3A表达治疗Angelman综合征

本研究针对Angelman综合征(AS)这一由母源UBE3A基因缺失导致的神经发育障碍，创新性地利用失活型NmCas9(dNmCas9)靶向Ube3a-ATS长链非编码RNA，通过转录干扰机制成功激活神经元中沉默的父源UBE3A表达。研究证实dNmCas9靶向Snord115序列能特异性下调Ube3a-ATS而不影响上游Snord116，并通过AAV载体在AS模型小鼠中实现剂量依赖性的表型改善。该研究为开发无基因组编辑风险的AS基因治疗提供了新思路。

　　

Angelman综合征(AS)是一种严重的神经发育障碍，由母源UBE3A基因突变或缺失引起。在神经元中，父源UBE3A(patUBE3A)会被长链非编码RNA Ube3a-ATS沉默，这使得AS患者神经元完全缺乏UBE3A蛋白表达。目前针对AS的治疗策略主要聚焦于激活沉默的父源UBE3A，包括小分子药物、反义寡核苷酸(ASO)和CRISPR/Cas9基因编辑等方法。然而这些方法存在基因组整合风险、Snord116调控紊乱等问题，亟需开发更安全有效的治疗手段。

为开发更安全的基因治疗策略，研究人员系统评估了失活型Cas9(dCas9)靶向Ube3a-ATS的可行性。研究采用的主要技术包括：1)构建多种dCas9变体(dSpCas9/dNmCas9)与gRNA表达载体；2)利用Ube3a^m+/YFP小鼠原代神经元进行体外功能验证；3)开发Ube3a-ATS报告基因系统分析转录干扰机制；4)通过AAV9载体进行新生AS模型小鼠(Ube3a^m-/p+)脑室内注射；5)采用行为学测试评估治疗效果。

dCas9靶向Snord115可特异性激活父源Ube3a

研究发现，靶向Snord115的dSpCas9无需KRAB染色质修饰域即可有效上调patUbe3a表达，且对Snrpn和matUbe3a无影响。通过设计靶向不同数量Snord115重复序列的gRNA，证实dCas9的转录干扰效果具有剂量依赖性，且对非模板链(NTS)的干扰效果显著优于模板链(TS)。

dNmCas9在体内外的治疗效应

研究人员进一步筛选出高效靶向112个Snord115位点的gRNA Nmg15，并构建AAV2/1-dNmCas9/Nmg15载体。体外实验显示dNmCas9可实现剂量依赖性的patUbe3a激活和Ube3a-ATS抑制，但达到相同效果需要比活性NmCas9更高的MOI。在人类神经元中，dNmCas9/NmhsaNT27能使父源UBE3A表达接近母源水平。

新生AS小鼠模型治疗评估

通过AAV9-PPP.eB载体将dNmCas9/Nmg15递送至新生AS小鼠脑室，发现皮层和海马中Ube3a-ATS显著下调，patUbe3a表达与dNmCas9剂量呈正相关。行为学分析显示治疗组小鼠后肢抓握表型明显改善，但在旋转棒、旷场等行为测试中未见显著恢复。

该研究首次证实无染色质修饰域的dCas9可通过转录干扰机制有效调控Ube3a-ATS，为AS治疗提供了新策略。相比传统CRISPR编辑，dCas9方法避免了DNA双链断裂风险和AAV基因组整合问题，且不干扰Snord116表达。尽管治疗效果尚有提升空间，但研究揭示了dCas9剂量与疗效的直接关系，为优化载体设计指明了方向。这项发表在《Communications Biology》的工作为开发更安全的神经疾病基因治疗奠定了重要基础。