靶向Cbl-b SH2结构域的磷酸化拟肽类正构抑制剂发现：基于优化荧光偏振竞争检测技术的肿瘤免疫治疗新策略

本研究针对肿瘤免疫治疗中Casitas B系淋巴瘤-b（Cbl-b）负调控TCR信号的关键机制，通过构建高灵敏度荧光示踪剂Tracer 2，建立优化的荧光偏振（FP）检测平台，筛选获得强效磷酸化拟肽类抑制剂Pep 19。该化合物可显著增强Jurkat细胞TCR信号通路及IL-2分泌，并在CT26同源小鼠模型中证实其免疫介导的抗肿瘤效应，为开发靶向Cbl-b SH2结构域的小分子抑制剂提供了先导化合物和技术支撑。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，T细胞受体（TCR）信号通路的负调控机制一直是科学家们关注的焦点。Casitas B系淋巴瘤-b（Cbl-b）作为关键的E3泛素连接酶，像一位"分子刹车手"般抑制着T细胞的活化。当这个调控机制过度活跃时，会导致肿瘤微环境中T细胞功能衰竭——这正是当前免疫治疗面临的主要瓶颈之一。虽然靶向PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂已取得突破，但仍有大量患者对治疗无应答，科学家们迫切需要找到新的靶点和干预策略。

中国药科大学李二东（Erdong Li）团队在《Journal of Medicinal Chemistry》发表的研究，将目光聚焦于Cbl-b的SH2（Src homology 2）结构域。这个特殊的"分子口袋"能特异性识别磷酸化酪氨酸（pTyr）位点，是调控Cbl-b功能的关键开关。研究人员设想：如果能设计出精准靶向该结构域的小分子抑制剂，就可能解除TCR信号通路的抑制，重新激活抗肿瘤免疫应答。但实现这一目标面临两大挑战：一是缺乏高效筛选技术，传统方法难以区分真正的正构抑制剂；二是现有肽类抑制剂存在稳定性差、膜穿透性低等问题。

为解决这些难题，研究团队首先基于已知肽类抑制剂Pep 1设计出新型荧光示踪剂Tracer 2，通过系统优化建立了灵敏度提升3倍的荧光偏振（FP）竞争检测体系。这个"分子雷达"能精确捕捉SH2结构域与抑制剂的结合动态，其Z'因子>0.8显示卓越的筛选稳定性。借助该平台，研究人员对磷酸化拟肽类化合物库进行筛选，最终获得先导化合物Pep 19。

在机制研究部分，表面等离子共振（SPR）分析显示Pep 19与Cbl-b SH2结构域的结合解离常数（K_D）达0.28 μM，比天然配体亲和力提高20倍。更令人振奋的是，在Jurkat T细胞模型中，Pep 19处理使TCR信号关键分子CD3ζ的磷酸化水平提升3.5倍，IL-2分泌量增加4.2倍，证实其能有效逆转Cbl-b的免疫抑制功能。动物实验则显示，在CT26结肠癌小鼠模型中，Pep 19治疗使肿瘤体积缩小62%，肿瘤浸润CD8⁺ T细胞比例增加3倍，且未观察到明显毒性。

这项研究的关键技术路线包括：1）基于结构指导设计荧光示踪剂；2）建立优化FP竞争检测体系；3）采用SPR验证结合特性；4）通过Western blot和ELISA分析细胞信号通路；5）构建CT26同源移植瘤模型进行体内验证。

【关键发现】

1. 1.

   示踪剂设计与FP检测优化：通过将Pep 1的pTyr-Glu-Asn核心序列与荧光素偶联，获得的Tracer 2在FP检测中显示显著信号窗口（mP差值>150），检测限低至0.1 μM。

2. 2.

   先导化合物发现：构效关系研究揭示，Pep 19的4-膦酸甲基苯丙氨酸替代天然pTyr是关键优化，使其细胞膜穿透性提升5倍。

3. 3.

   信号通路激活：Pep 19处理使Jurkat细胞中ZAP-70和PLCγ1磷酸化水平分别提升2.8倍和3.1倍，证实其通过TCR-CD3通路发挥作用。

4. 4.

   体内抗肿瘤效应：在CT26模型中，Pep 19联合PD-1抗体使完全缓解率从20%提升至60%，显示协同治疗潜力。

这项研究的意义不仅在于发现Pep 19这个具有转化潜力的先导化合物，更建立了靶向Cbl-b SH2结构域的标准化筛选平台。特别值得注意的是，Pep 19作为首个被证实具有体内活性的正构（orthosteric）Cbl-b抑制剂，其作用机制不同于常见的变构调节剂，为开发新一代肿瘤免疫治疗药物提供了全新思路。研究人员在讨论中指出，该化合物的拟肽结构虽仍需优化以提高口服生物利用度，但其明确的靶点作用机制和显著的免疫激活效应，使其成为连接基础研究与临床转化的重要桥梁。这项成果也为探索SH2结构域靶向策略在其他免疫调节中的应用提供了范式。