自激活型分裂Dre重组酶在哺乳动物细胞和大肠杆菌中实现高效位点特异性重组

本研究针对现有位点特异性重组(SSR)系统存在的非特异性表达和毒性问题，创新性地开发了自激活型分裂Dre重组酶系统。通过同源比对设计多组分裂位点，发现N191/192C组合可在293T细胞、4T1细胞和E. coli中高效介导rox位点重组，且与分裂Cre蛋白无交叉互补作用。该成果为基因编辑和转基因动物研究提供了新工具。

　　

在基因编辑领域，位点特异性重组(SSR)系统犹如精准的"分子剪刀"，被广泛应用于条件性基因操作。然而现有技术面临三大困境：重组酶的非特异性表达导致脱靶效应、生殖细胞中的意外重组造成全身性基因敲除、以及重组酶过表达引发的细胞毒性。这些问题严重制约了SSR系统在精细遗传操作中的应用，特别是在需要同时标记多种细胞类型或研究特定细胞亚群功能时。

传统解决方案如光/化学诱导系统虽能提高时空控制精度，但仍无法满足多标记需求。而分裂重组酶技术——将酶切成两个需要重新组装才能激活的部分——为这一难题提供了新思路。虽然已有光激活的分裂Dre重组酶报道，但无需外界刺激的自激活型分裂Dre系统仍是空白。这正是Chichu Xie等人在《Journal of Biological Engineering》发表的研究所要攻克的关键问题。

研究人员采用的主要技术方法包括：基于Cre同源性的分裂位点设计策略；构建含rox位点的报告质粒系统；流式细胞术定量重组效率；Western Blot检测蛋白表达；以及在大肠杆菌中建立β-半乳糖苷酶活性检测体系。实验涉及293T、4T1两种哺乳动物细胞系和E. coli DH5α菌株。

研究结果部分的重要发现包括：

"Identification of constitutively active split Dre protein combinations in 293T cells"：通过同源比对选择6个分裂位点构建N/C端片段组合。其中N191/192C在游离型rox位点重组中表现出7%的活性，而其他组合几乎无活性。有趣的是，该组合在介导缺失和倒位反应时效率相当。

"Efficient site-specific recombination is mediated by split Dre proteins in rox site-stable 293T cells"：在基因组整合rox位点的稳定细胞系中，N191/192C表现出比完整Dre更高的重组效率。添加核定位信号(NLS)可进一步提升效率，而intein肽段融合会抑制该组合活性。

"Split Dre proteins mediate efficient site-specific recombination in mouse cell lines"：在4T1细胞中，N191/192C实现近100%重组效率，intein融合的N60/61C也显示相近活性，验证了系统在哺乳动物细胞的普适性。

"Split Dre proteins mediate efficient site-specific recombination in prokaryotic E. coli cells"：通过构建pACYC177-roxLacZα(rox)报告系统，证实N191/192C在原核细胞中具有与完整Dre相当的活性。

"The split forms of Dre and Cre proteins demonstrate a clear absence of functional cross-complementation"：交叉组合实验表明分裂Dre(N191/192C)与分裂Cre(N190/191C)在识别各自靶序列(loxP/rox)时严格互不干扰。

研究结论指出，N191/192C分裂组合和intein融合的N60/61C组合均能高效介导基因组整合rox位点的重组，且无需外界诱导。特别重要的是，分裂Dre与Cre系统可同时使用而互不干扰，这为多重遗传操作提供了可能。这些发现不仅丰富了基因编辑工具库，更为细胞谱系追踪、条件性基因敲除等研究开辟了新途径。

该研究的创新性体现在三方面：首次报道自激活型分裂Dre系统；发现intein融合对不同分裂组合的差异化影响；验证分裂Dre/Cre系统的正交性。这些发现为发展更精准的遗传操作策略奠定了重要基础，特别是在需要多重标记的复杂生物学问题研究中展现出独特价值。