无标记定量测量多组分生物分子凝聚体组成的创新方法及其在相分离研究中的应用

本研究针对当前生物分子凝聚体组成测量技术存在的标记干扰和组分限制问题，开发了一种基于定量相位成像(QPI)和折光率分析的无标记方法(ATRI)。该方法成功解析了含RNA和多种RNA结合蛋白的重构凝聚体中五种大分子溶质的浓度，揭示了密度与组成的意外解耦现象，为研究多组分凝聚体的组成调控机制提供了重要工具。

　　

细胞内的许多区室是由多种组分构成的生物分子凝聚体(biomolecular condensates)，这些液-液相分离形成的结构在细胞生理过程中起着关键作用。然而，现有的凝聚体组成测量技术存在明显局限：荧光标记可能干扰组分平衡，而紫外吸收等方法通常仅适用于二元系统。特别是在研究全长天然蛋白质时，由于难以获得足够量的样品，传统的体相测量方法往往无法应用。这些限制严重阻碍了对多组分凝聚体组成-功能关系的深入理解。

针对这一技术瓶颈，Patrick M. McCall等研究团队在《Nature Chemistry》上发表了一项创新研究，开发了一种基于定量相位成像(quantitative phase imaging, QPI)的无标记方法，结合连接线分析(analysis of tie-lines and refractive index, ATRI)，实现了对多组分生物分子凝聚体组成的精确测量。该方法仅需传统技术千分之一的样品量，不仅能用于全长蛋白质形成的凝聚体，还能同时解析多达五种组分的浓度。

研究采用了三项关键技术：(1)定量相位成像系统测量微米级液滴的折光率差异(Δn)；(2)光学衍射断层扫描(optical diffraction tomography, ODT)验证QPI结果；(3)质谱(MS)和紫外-可见光谱(UV-vis)联用确定稀相组成。通过分析连接线和折光率，建立了多组分相图。

研究首先验证了QPI在二元系统中的准确性。通过PEG/葡聚糖两相系统和二氧化硅微球验证，证明该方法能精确测量Δn(图1i,j)。对全长PGL-3蛋白凝聚体的测量显示，其浓度呈对称分布，平均值达87.0±0.1 mg ml^-1(图2c)，且QPI与ODT结果高度一致。温度实验揭示了FUS和TAF15(RBD)凝聚体浓度随温度变化的复杂关系(图2d)。

研究发现荧光标记会显著影响测量结果。mEGFP标记使PGL-3凝聚体质量浓度增加14%，但摩尔浓度实际降低(补充表1)。更严重的是，荧光强度与浓度的关系在凝聚相和稀相间存在显著差异：mEGFP荧光低估浓度达10倍以上，AF546标记也低估3.6倍(图2f)。这凸显了无标记方法的必要性。

时间分辨QPI揭示了二元系统的复杂老化动力学。PGL-3凝聚体在20小时内浓度增加近2倍，而体积相应减小，总分子数仅减少15%(图3b-d)。这种老化动态表现出明显的尺寸依赖性(图3f,g)，可能与Ostwald熟化和老化过程的共同作用有关。

ATRI方法在多组分系统中展现出强大能力。通过结合QPI测得的Δn和连接线信息，成功构建了FUS/RNA三元系统的完整相图(图4e,f)。有趣的是，增加RNA浓度会导致蛋白质浓度相应降低，维持总体积分数恒定(图4g)。进一步将ATRI扩展到五组分系统(含RNA和四种蛋白质构建体)，通过MS western定量稀相组成，解析了各组分在凝聚相中的浓度(图5d,e)。相图预测的凝聚相体积分数与QPI实测值高度相关(r=0.827)(图5i)，验证了方法的准确性。

这项研究开发的无标记ATRI方法突破了现有技术的限制，首次实现了对多组分生物分子凝聚体组成的精确测量。其重要意义体现在：(1)千分之一的样品需求使全长天然蛋白质研究成为可能；(2)时间分辨率达秒级，可捕捉动态过程；(3)能同时解析多达五种组分的浓度；(4)为荧光标记提供了"真实标准"，有助于校准荧光行为。该方法将推动对多组分凝聚体组成-性质关系的机制研究，并为设计合成凝聚体中的化学反应提供关键工具。特别值得注意的是，研究发现密度与组成存在解耦现象，强调了在多组分系统中同时测定分子化学计量学的重要性。