简化杂交捕获技术Trinity：实现无PCR工作流程并提升基因组靶向测序性能

研究人员针对传统杂交捕获(Hybrid capture)技术流程复杂、耗时长且影响文库复杂度的问题，开发了Trinity技术。该技术通过链霉亲和素修饰的流动池表面直接捕获生物素化探针，结合滚环扩增(RCA)实现1小时快速杂交，消除了磁珠捕获、多次洗涤和杂交后PCR步骤。结果显示，该技术将工作流程缩短50%以上，重复率降低67%， indel(插入缺失)检测假阳性降低89%，并首次实现无PCR的全外显子组测序(Exome sequencing)和HTT(亨廷顿病相关基因)重复扩展检测。

　　

基因组研究领域长期面临一个关键挑战：如何高效精准地捕获特定DNA片段？传统杂交捕获技术自15年前问世以来，虽然成为外显子组测序和肿瘤基因panel的黄金标准，但其繁琐的磁珠捕获、温度控制洗涤和杂交后PCR扩增步骤，不仅导致工作流程长达12-24小时，更会引入序列偏差、降低文库复杂度，尤其影响插入缺失(indel)变异的检测准确性。这些问题严重制约了临床研究和诊断的效率，特别是在需要快速周转的肿瘤基因组学和遗传病检测领域。

Element Biosciences团队在《BMC Genomics》发表的这项研究，开发了名为Trinity的革命性技术。该技术通过三大创新突破：1）开发链霉亲和素(streptavidin)修饰的流动芯片表面，直接捕获生物素化探针-文库复合物；2）在流动池上完成靶标环化和滚环扩增(RCA)；3）优化1小时快速杂交方案。这些改进使整个工作流程从文库制备到测序可在5小时内完成，较传统方法提速50%以上。

关键技术方法包括：使用HG001-HG004等标准细胞系和FFPE样本，通过酶切或机械剪切制备DNA文库；采用Element Biosciences开发的链霉亲和素流动池（货号860-00019）；使用IDT xGen和Twist等外显子捕获panel；通过Sentieon BWA-MEM比对hg38基因组，DeepVariant(v1.6.1)进行变异检测，ExpansionHunter(v5.0.0)分析重复扩展；采用216个外显子样本验证技术稳定性。

工作流程和性能比较

研究团队通过图1直观对比传统流程与Trinity的差异：

。关键数据体现在表1：使用两个厂商panel测试24个样本，Trinity在fold-80（覆盖均匀性指标）和重复率（1.17% vs 2.31%）上全面超越传统方法，其中indel检测F1值从0.957提升至0.975。更惊人的是，在216个外显子样本的大规模验证中，所有技术参数变异系数<5%，证明其卓越的稳定性。

不同panel尺寸评估

研究揭示了一个重要规律：

。测试从730kb（0.024%基因组）到43Mb（1.39%基因组）的10个panel发现，800kb肿瘤panel的on-target率从85.4%提升至88.9%（p<0.0001），43Mb外显子panel从84.4%提升至89.4%。这为定制化panel设计提供了明确指导：96-plex检测中，200kb小panel需96μg总DNA（1μg/样本），而大panel仅需3μg。

体细胞应用验证

在7,901探针的肿瘤panel测试中（图3），

。Trinity使重复率从56%降至33%，平均靶标覆盖度从871X提升至1430X，为低频突变检测创造了条件。

无PCR工作流程突破

最具颠覆性的成果体现在图4：

。结合Element Elevate机械法建库，首次实现全流程无PCR的外显子测序，文库复杂度提升4.4倍。在亨廷顿病HTT基因检测中（图5），

，45和70个CAG重复的致病性扩展均被精准识别，为重复扩展疾病诊断开辟新途径。

这项研究标志着靶向测序技术进入新时代。Trinity技术不仅解决了传统杂交捕获的操作瓶颈，其无PCR特性更带来了基因组医学检测范式的转变——从indel检测准确性的大幅提升，到重复扩展疾病的分子诊断，再到未来液态活检中低频突变的挖掘潜力。虽然当前存在96-plex通量限制和部分重复区域覆盖不足等问题，但随着流动池原位杂交等技术的开发，这项突破性技术有望在肿瘤早筛、遗传病诊断和微生物组分析等领域产生深远影响。