活体组织单细胞分辨率3D成像与分割技术的突破性进展及其在果蝇翅盘研究中的应用

本研究针对活体组织中上皮细胞3D结构定量分析的难题，开发了集样本制备、成像和深度学习辅助分割于一体的完整技术方案。研究人员通过优化果蝇(Drosophila)翅盘(wing disc)的活体成像条件，结合Cellpose算法和TrackMate追踪技术，建立了"人在环路"(human-in-the-loop)的3D分割流程，实现了伪复层上皮(pseudostratified epithelia)中复杂形态细胞的精确量化，为组织形态发生研究提供了新工具。

　　

在生命科学研究中，上皮细胞能够形成从扁平鳞状到高度折叠的复杂三维结构，这些结构的精确量化对于理解组织发育和形态发生至关重要。然而，传统技术难以在活体组织中实现单细胞水平的三维成像和分割，特别是在果蝇翅盘(wing disc)这类具有伪复层上皮(pseudostratified epithelia)特征的组织中，细胞密度高、形态复杂且存在沿顶基轴(apico-basal axis)的邻居交换现象(scutoids)，给精确量化带来了巨大挑战。

针对这一技术瓶颈，由Giulia Paci、Pablo Vicente-Munuera和Yanlan Mao等研究人员在《npj Imaging》发表的研究，建立了一套从样本制备到定量分析的完整技术方案。研究团队选择果蝇翅盘作为模型系统，通过优化活体成像条件和开发深度学习辅助的分割算法，成功实现了厚达50μm组织中单个细胞的三维精确量化。

关键技术方法包括：(1)使用双光子(two-photon)激发和浸水物镜(dipping objective)的成像系统，优化了活体组织的深层成像；(2)建立基于Cellpose深度学习框架的初始分割流程，结合"人在环路"(human-in-the-loop)策略进行人工校正；(3)利用TrackMate实现三维"缝合"(stitching)校正；(4)开发"细胞持久性评分"(Cell Persistence score)新指标评估分割质量；(5)通过napari平台进行三维可视化和定量分析。

【样本制备与成像优化】

研究人员详细描述了果蝇翅盘的解剖和固定方法，创新性地使用Cell-Tak生物相容性粘合剂将组织固定在培养皿底部，通过浸水物镜在培养基中进行成像。这种制备方法最大程度减少了折射率不匹配导致的信号损失，配合双光子924nm激发波长，实现了从顶端到底部约100个切面的高质量三维成像。值得注意的是，研究发现图像去卷积(deconvolution)虽然改善了视觉效果，但反而降低了Cellpose算法的分割准确性，这可能与训练数据特性有关。

【深度学习辅助分割】

研究团队系统比较了多种分割策略后，确立了以Cellpose预训练模型"cyto3"为基础的流程。该模型虽然在二维图像上训练，但通过调整z轴比例参数(z-aspect)，能够初步识别三维结构中的细胞轮廓。针对果蝇翅盘中细胞沿z轴形态变化的挑战，研究创新性地将TrackMate追踪算法重新用于三维"缝合"，通过设置初始半径(Initial radius)20、搜索半径(Search radius)25和允许缺失帧数(Number of missing frames)2等参数，显著改善了细胞在深度方向上的连续性。

【质量评估与模型优化】

为解决缺乏真实数据评估的难题，研究提出了"细胞持久性评分"，量化细胞在最小百分比z切面中被连续追踪的程度。使用这一指标，研究人员发现初始分割的主要问题在于z轴"缝合"而非二维平面识别。通过将三维数据转换为XY、YZ和XZ切片进行迁移学习(transfer learning)，用少量标注数据微调模型，分割质量得到显著提升。但研究也警示，如果训练数据缺乏背景区域，可能导致模型在空白区域错误预测细胞。

【三维可视化与分析】

最终分割结果在napari平台实现三维可视化，通过"regionprops"功能提取细胞体积、形状等特征。研究特别强调，在伪复层上皮中，大多数细胞应贯穿整个组织顶基轴，这一特性使"细胞持久性评分"成为评估分割质量的有效指标。整套流程在配备NVIDIA RTX A5000显卡的工作站上运行，3468张二维图像的模型微调约需2天计算时间。

这项研究的意义不仅在于建立了果蝇翅盘的三维量化方法，更开发了一套适用于多种组织的通用技术框架。通过整合光学物理优化（减少散射和像差）、计算算法创新（深度学习与追踪技术结合）和新型评估指标（细胞持久性评分），解决了厚组织中复杂形态细胞的分割难题。特别值得注意的是，研究强调样本制备和成像优化对后续分析的决定性影响，这一经验对各类活体成像研究具有重要参考价值。

研究团队公开了全部代码和样本数据集，为方法推广奠定了基础。尽管目前流程仍需约一周时间进行人工校正，但随着算法进步和计算能力提升，这一技术有望实现更高效的自动化分析。未来，这种方法可拓展至其他模式生物和组织类型，推动发育生物学和组织形态发生研究进入更精确的三维量化时代。